Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России

Диссертация

Автор: Лаповок, Илья Андреевич

Заглавие: Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России

Справка об оригинале: Лаповок, Илья Андреевич. Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Лаповок Илья Андреевич; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 112 с. ил. Москва, 2009 112 c. :

Физическое описание: 112 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

Введение
Обзор литературы
1 Открытие вируса иммунодефицита человека первого типа
2 Строение вириона ВИЧ-1
3 Организация генома ВИЧ-1
31 Структура и функции ЬТЯ провирусной ДНК ВИЧ-1
311 Структура и функции из-региона 5'-ЬТК провирусной ДНК
312 Структура и функции Я-региона 5'-ЬТК провирусной ДНК
313 Структура и функции Ш-региона 5'-1ЛИ провирусной ДНК
32 Структура области вирусной РНК, предшествующей ?а?-стартовому ко дону
321 Вторичная структура и функции шпильки БК (БЫ) РНК ВИЧ-1
322 Вторичная структура и функции шпильки ББ (8Ь2) РНК ВИЧ-1
323 Вторичная структура и функции шпильки у (БЬЗ) РНК ВИЧ-1
324 Шпилька БЬ4
325 Ш-АШ-дуплекс
326 Структура областей между шпильками
327 Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1
33 Структурные гены ВИЧ-1
331 Ген
332 Генро1
333 Ген ет
34 Гены и основные функции регуляторных и вспомогательных белков
341 Строение Ург
342 Положение и синтез Ург
343 Функции Ург
3431 Влияние на точность обратной транскрипции
3432 Ург и импорт в ядро преинтеграционного комплекса
3433 Ург и клеточный цикл
3434 Разрушение двунитевой ДНК
3435 Ург и апоптоз
3436 Роль Ург в усилении 1ЛИ-направленной транскрипции
4 Этапы ВИЧ-инфекции
41 Ранняя и текущая инфекция
41 Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции
5 Анализ полиморфизма ВИЧ-1 как инструмент эпидемиологического мониторинга „
51 Деление вируса на подтипы
53 Природа изменчивости ВИЧ-1
52 Полиморфизм вируса
6 Молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции в России
61 Эпидемия ВИЧ-инфекции в России
62 Подтипы ВИЧ-1, обнаруживаемые в России
7 Генная терапия ВИЧ-инфекции
71 Терапии, базирующиеся на применении нуклеиновых кислот
72 Терапия, базирующаяся на белках
Экспериментальная часть
1 Материалы и методы
11 Объект исследования
12 Сбор эпидемиологических данных
13 Методы дифференциального анализа ранней и текущей инфекции
131 Чувствительный/низкочувствительный иммуноферментный анализ (S/LS ELISA)
132 Иммуноферментный анализ с использованием хаотропного агента
133 ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 (ИДЭ
134 Изотип-специфический Western blot
14 Метод получения «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови
15 Анализ электрофоретической подвижности молекул в агарозном геле
16 Применение метода гнездовой ПЦР для получения ампликонов исследуемых областей ДНК
161 Амплификация нуклеотидных последовательностей области 5-LTR
162 Амплификация нуклеотидных последовательностей области, предшествующей gag - стартовому ко дону
163 Амплификация области гена vpr
17 Метод очистки ДНК из геля методом Jetquick
18 Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК
2 Результаты
21 Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции
211 Чувствительный/низкочувствительный ИФА
212 ИФА с использованием 8М мочевины
213 ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41
214 Изотип-специфический Western blot
22 Анализ области 5-LTRпровирусной ДНК варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России
221 Филогенетический анализ области 5'-LTR
222 Анализ области U3
223 Анализ области R
224 Анализ области U5
23 Анализ области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ-1
24 Анализ области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1
241 Филогенетический анализ области гена vpr
242 Анализ мутаций в структуре гена vpr
Обсуждение
Выводы

Введение:
Актуальность проблемы. С момента открытия в 1983 г. вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) он является предметом пристального изучения [Бобков и др., 2003]. В связи с ростом эпидемии ВИЧ-инфекции, в том числе и в России, вопрос о разработке эффективных средств борьбы с заболеванием становится все более острым. Главными препятствиями в этой борьбе служат выраженный токсический эффект существующих препаратов и явление лекарственной устойчивости вируса к ним. Для преодоления этих проблем постоянно проводится поиск новых лекарственных препаратов, воздействующих на различные этапы жизненного цикла вируса. В качестве объектов воздействия будущей антиретровирусной терапии рассматриваются, в частности, регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1. Другим многообещающим подходом может стать генная терапия ВИЧ-инфекции, непосредственной мишенью которой являются нуклеотидные последовательности генома вируса, и среди них — нетранслируемые области генома, необходимые для осуществления его жизненного цикла.
Для разработки средств воздействия на белки и гены вируса необходимы детальные сведения об их структуре, которая у ВИЧ-1 отличается высокой степенью изменчивости. Анализ структуры генома полиморфных вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в разных регионах мира, проводится постоянно, результатом чего стало создание обширных баз данных нуклеотидных последовательностей основных, в первую очередь структурных, генов вируса.
Среди областей генома ВИЧ-1, полиморфизм которых пока изучен недостаточно, можно выделить регион длинных концевых повторов (LTR, long terminal repeat) провируса. Этот регион содержит большое количество сайтов связывания для специализированных клеточных и вирусных факторов транскрипции [Pereira et al, 2000; Van Opijnen et al, 2004] и необходим для инициации вирусной транскрипции, а также вовлечен в процесс обратной транскрипции и интеграции [Ramirez de Arellano et al, 2006], являясь, таким образом, контрольным центром генетической экспрессии ВИЧ-1. Несмотря на высокую консервативность этой области, описано явление полиморфизма LTR среди различных вариантов и подтипов ВИЧ-1 [Estable et al, 1996].
Решающую роль в процессе специфической упаковки геномной РНК в нарождающиеся вирусные частицы играет регион, предшествующий gag-стартовому кодону РНК вируса, в составе которого выделяют три шпилечные структуры - DIS, SD и Y, играющие важнейшую роль в процессе созревания вирионов и упаковки РНК в геноме вновь формирующихся вирусных частиц. В составе вирусной РНК эти регионы, имеющие 5 специфическую вторичную структуру, образуют домены, отвечающие за процесс инициации димеризации двух цепей РНК, образования квадруплексов, стабилизирующих димеры, и упаковки генома ВИЧ-1 непосредственно в вирионы. Показано, что полиморфизм этой области может оказывать влияние на скорость репродукции вируса и, в конечном счете, на прогрессию ВИЧ-инфекции.
Значительным влиянием на различные этапы жизненного цикла ВИЧ-1 обладает вспомогательный вирусный белок Vpr (viral protein R) [Le Rouzic et al, 2005]. Этот белок оказывает свое влияние на процессы обратной транскрипции, интеграции провируса, транскрипции вирусных генов, а также на жизненный цикл клетки и процесс апоптоза. В литературе имеется описание некоторых мутаций гена vpr, влияющих на многообразные активности белка Vpr.
Несмотря на существование полиморфизма области 5'-LTR, региона РНК, предшествующего gag-стартовому ко дону, и гена vpr ВИЧ-1, данные литературы свидетельствуют о том, что они достаточно консервативны в условиях естественного развития инфекции, а значит, могут быть использованы для создания новых средств антиретровирусной терапии.
Цель и задачи исследования. Определение степени изменчивости региона 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, а также гена vpr для варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, и научное обоснование возможности использования этих областей генома в качестве мишеней для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции и для разработки новых методов лечения ВИЧ-инфекции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Проанализировать нуклеотидные последовательности ДНК области 5'-LTR, нетранслируемой области перед gag-стартовым кодоном и области гена vpr в образцах варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, выделенных в разных регионах России в период с 1996 по 2004 годы.
2. Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости исследуемых областей варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1 в динамике эпидемии ВИЧ-инфекции в различных регионах России.
3. Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций на эффективность репродукции вируса и прогрессию ВИЧ-инфекции.
4. Разработать алгоритм дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции на основе серологических методов.
5. Провести сравнение исследуемых областей ВИЧ-1 в группах пациентов, находящихся на ранней и последующих стадиях ВИЧ-инфекции.
Научная новизна и практическая значимость работы. Продемонстрирован низкий уровень изменчивости области 5'-LTR, области шпилек DIS, SD и ц/ и гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России. Анализированные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 депонированы в GenBank под номерами: EU938080-EU938124 для области 5'-LTR (45 образцов), FJ437007 - FJ437028 и FJ503049-FJ503059 - для области шпилек DIS, SD и у (33 образца), FJ490707 - FJ490751 для гена vpr (45 образцов).
Показано, что в структуре 5'-LTR провирусной ДНК имеются участки, специфические для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А. Данные результаты свидетельствуют о том, что область LTR варианта подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, является характерной для данного подтипа, и анализ этого региона может быть использован для генотипирования наряду с анализом структурных генов gag и env. В частности, показано, что для всех образцов варианта IDU-A ВИЧ-1, выделенных от не употреблявших антиретровирусную терапию людей, характерно наличие вставки в области так называемых «наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов» (MFNLP) в положении -118 внутри региона NF-kB-сайтов LTR, достаточно часто встречающейся среди штаммов ВИЧ-1 подтипов А, С, D, F, H и J по сравнению с подтипом В [Estable et al, 1996; Ramirez de Arellano et al, 2006]. В большинстве (43 из 45) исследованных образцов вставка размером в 12 нуклеотидов имела дополнительный сайт RBE III, связывающий фактор RBF-2, что потенциально способно оказывать отрицательный эффект на репликацию вируса в клетках [Estable et al, 2007; Ramirez de Arellano et al, 2006].
В составе концевой петли шпильки DIS абсолютного большинства всех российских образцов (91%) обнаружен палиндром AG[GUGCAC]A, характерный для подтипа А ВИЧ-1 [Zarudnaya et al, 2006]. Единичные замены в составе концевой петли, обнаруженные у трех образцов, по всей вероятности, не оказывают значительного влияния на процесс димеризации и упаковки вирусной РНК. Также у двух из 33-х образцов выявлены мутации в 5-м положении шпильки SD, что потенциально может быть связано с ускоренным прогрессированием инфекции [Fang et al, 2001]. Высокий уровень полиморфизма характерен для промежутка между шпильками SD и v|/, однако различия в этой области не способны оказать серьезного влияния на вторичную структуру шпилек.
Низкий уровень изменчивости области гена vpr вариантов ВИЧ-1 IDU-A делает его привлекательной целью для антиретровирусной терапии. В структуре гена vpr изученных образцов не было обнаружено мутаций, связь которых с изменением активностей белка Vpr доказана, при этом были отмечены некоторые характерные для российского варианта
ВИЧ-1 подтипа А особенности, которые могут служить дополнительным инструментом в изучении молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции на территории России и потенциально способны влиять на функции белка. Так, обнаружена значительная вариабельность в 89-м аминокислотном положении Ург. Также была выявлена вариабельность в 73-м и 80-м положении, а в одном образце обнаружена замена 16IV. Мутации в последних трех положениях могут оказывать влияние на проалоптозную активность Ург, ослабляя ее и тем самым, замедляя патогенез инфекции [Ьиш е! а1, 2003; Лап е1 а1, 2003]. Кроме того, в ряде образцов имелись замены в положениях 25 и 63, критических для способности белка проникать в ядро клетки и накапливаться там [ТеПг1еп а1,1998; Моге11е1 е1 а1, 2003]; в трех образцах обнаружены делеции.
В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием для использования областей 5'-ЬТЯ, 5'-11ТК и гена хрг в качестве мишеней при разработке новых методов лечения ВИЧ-инфекции, включая генную терапию, и новых средств мониторинга ВИЧ-1 с дальнейшим внедрением их в клиническую и эпидемиологическую практику.
Положения, выносимые на защиту.
1. Анализ нуклеотидных последовательностей региона 5'-ЬТ11, области, предшествующей ?Я?-стартовому кодону, и гена ург доминирующего в России варианта ГОи-А ВИЧ-1 подтверждает его принадлежность к подтипу А вируса.
2. Строение и количество сайтов связывания №-кВ и 8р1, а также структура ТАТАА-бокса в составе 5'-ЬТК ГОи-А являются типичными для всех вариантов подтипа А ВИЧ-1.
3. Характерной особенностью варианта ГОИ-А ВИЧ-1 является наличие области МРЫЬР размером 12 нуклеотидов, содержащей дополнительный сайт связывания для фактора 11ВР-2, в составе Ш региона ЬТ11.
4. Вторичная структура участков, наиболее важных для репликации вируса, в составе региона, предшествующего ?а?-стартовому кодону вирусной РНК, характерна для подтипа А.
5. Мутации, ассоциированные, по данным литературы, с изменениями активностей белка Ург, в составе варианта Ш11-А ВИЧ-1 отсутствуют.
6. Разработан иммуноферментный метод дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции.
7. Отсутствие ассоциации между сроком инфекции и структурой исследованных областей генома ВИЧ-1 позволяет рекомендовать их для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции.
Обзор литературы