Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / АРХИТЕКТУРА / Архитектура зданий и сооружений. Творческие концепции архитектурной деятельности

Архитектурно-пространственная организация объектов отдыха и туризма в пойменно-дельтовых образованиях : на примере Волго-Ахтубинской поймы

Диссертация

Автор: Антюфеев, Владимир Алексеевич

Заглавие: Архитектурно-пространственная организация объектов отдыха и туризма в пойменно-дельтовых образованиях : на примере Волго-Ахтубинской поймы

Справка об оригинале: Антюфеев, Владимир Алексеевич. Архитектурно-пространственная организация объектов отдыха и туризма в пойменно-дельтовых образованиях : на примере Волго-Ахтубинской поймы : диссертация ... кандидата архитектуры : 18.00.02 / Антюфеев Владимир Алексеевич; [Место защиты: Моск. архитектур. ин-т] Москва, 2007 217 c. : 61 07-18/44

Физическое описание: 217 стр.

Выходные данные: Москва, 2007






Содержание:

1 Введение
2 Обзор литературы
21 Современные методы изучения структуры биологических систем
22 Получение меченых соединений методом термической активации трития
221 Радикальные реакции атомов водорода
222 Источник атомов трития и условия мечения
223 Примеры получения меченных тритием биологически активных соединений
23 Основы метода тритиевой планиграфии
24 Техника эксперимента и анализ данных в методе тритиевой планиграфии
25 Применение метода тритиевой планиграфии для исследования доступной поверхности макромолекул
26 Изучение различных биологических систем методом тритиевой планиграфии
261 Исследование доступной поверхности белков
262 Исследование конформационных переходов и внутримолекулярной динамики белков
263 Моделирование пространственной структуры белков по данным тритиевой планиграфии
264 Изучение пространственной организации надмолекулярных систем
27 Вирус табачной мозаики
271 Изучение структуры вирионов дикого штамма
ВТМ методом тритиевой планиграфии
272 Современный взгляд на структуру ВТМ и агрегатов его белка оболочки
273 Температуро-чувствительные мутанты ВТМ по белку оболочки
274 Гиперчувствительный ответ при заражении растений тобамовирусами
3 Экспериментальная часть
31 Объекты исследования и реактивы
32 Накопление и выделение вирионов дикого и мутантного штаммов ВТМ
33 Выделение белка оболочки ВТМ
34 Схема проведения эксперимента
35 Введение тритиевой метки
36 Тонкослойная хроматография смесей аминокислот
37 Ультрацентрифугирование вирусных суспензий
38 Ферментативный гидролиз белков
39 Кислотный гидролиз пептидов и белков
310 Методы исследования
3101 Стационарное измерение радиоактивности
3102 УФ-спектроскопия
3103 Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе
3104 Аминокислотный анализ с измерением радиоактивности элюата
311 Оптимизация условий проточного измерения радиоактивности
Результаты и их обсуждение
41 Разработка методики измерения радиоактивности элюата с аминокислотного анализатора с помощью проточного сцинтилляционного счетчика
411 Особенности измерения радиоактивности элюата
412 Подбор сцинтилляционных жидкостей
413 Сравнение результатов проточного измерения радиоактивности элюата и стационарного счета его фракций
414 Определение параметров регистрации при проточном измерении радиоактивности
42 Оптимизация условий введения тритиевой метки на модельной системе
421 Модельная система
422 Накопление суммарной радиоактивности смесей аминокислот
423 Включение тритиевой метки в индивидуальные аминокислоты
424 Экранирующее действие воды при введении метки
43 Исследование эффективности включения тритиевой метки в белок оболочки дикого штамма вируса табачной мозаики в зависимости от времени реакции
44 Сравнительное изучение пространственной организации дикого вируса табачной мозаики (U1) и его мутанта ts21
441 Введение метки и фрагментация белка оболочки
442 Сравнение результатов введения тритиевой метки в дикий и мутантный белок оболочки в различных агрегационных состояниях
443 Расчеты доступной поверхности для белка оболочки дикого ВТМ (U1)
444 Различия в пространственной организации дикого ВТМ (U1) и его мутанта ts21и их роль в индукции гиперчувствительного ответа
5 Выводы

Введение:
Современные достижения в изучении многих биологических процессов на молекулярном уровне стимулировали поиск и разработку новых подходов к исследованию структурной организации многокомпонентных надмолекулярных объектов, определению размера и состава поверхностей взаимодействующих компонентов таких систем. Основным методом установления пространственной структуры молекул белков и нуклеиновых кислот, а также их специфических надмолекулярных комплексов, был и остается метод рентгеноструктурного анализа (PCА). В последнее время к нему добавилась и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Однако использование обоих этих методов не свободно от существенных ограничений. Методом ЯМР на сегодняшний день удается исследовать биологические молекулы и их комплексы с молекулярной массой не более -30 кДа. Использование же метода PC А, как правило, требует предварительного получения высокоупорядоченных кристаллов исследуемого объекта, что, во-первых, зачастую представляет собой трудноразрешимую задачу, и, во-вторых, может приводить к изменению структуры молекул по сравнению с той, которую они имели в растворе.
Одним из альтернативных методов исследования структуры биологических объектов является разработанный в нашей стране метод тритиевой планиграфии (от латинского planum - поверхность и греческого grapho - пишу). За работу "Химия горячих атомов трития как основа метода исследования поверхностных молекулярных слоев и структуры биополимеров" коллективу авторов, разработавших данный метод, была присуждена Государственная премия Российской Федерации в области науки и техники (2000 г.). Метод тритиевой планиграфии позволяет определить стерическую доступность углеводородных групп исследуемого биологического объекта (макромолекулы или надмолекулярного комплекса) при бомбардировке его атомарным тритием, образующимся при диссоциации молекулярного газа на нагретой до 2000 К вольфрамовой проволоке. Результатом бомбардировки, проводимой в специальной вакуумной установке, является химическое замещение водорода на его радиоактивный изотоп тритий, которое происходит во всех стерически доступных элементах объекта в тонком поверхностном слое мишени. Последующий анализ распределения метки по индивидуальным аминокислотным остаткам молекулы белка позволяет с достаточной точностью идентифицировать поверхностно-локализованные участки молекулы (или молекул в составе надмолекулярных комплексов). При этом высокая чувствительность метода тритиевой планиграфии позволяет регистрировать весьма малые изменения пространственной структуры, не обнаруживаемые другими традиционными методами.
Установление молекулярных механизмов патогенеза является едва ли не центральной проблемой при изучении взаимодействия "патоген-хозяин" в самых разных системах. Необходимым условием для проведения исследований такого рода является наличие адекватных модельных систем, в которых изменения структуры патогена вызывают строго определенные изменения реакции организма-хозяина. В растительной вирусологии такие модели появились сравнительно недавно. Одна из наиболее изученных моделей этого типа - комбинация вируса табачной мозаики (ВТМ) и растений Nicotiana sylvestris, несущих ген устойчивости N'. Показано, что на этом хозяине дикий (U1) штамм ВТМ вызывает системную реакцию (мозаику - желто-зеленые пятна на листьях), а большинство других тобамовирусов и целый ряд мутантов штамма U1 - некротическую реакцию (формирование некрозов - маленьких точек - на инфицированных листьях). Считается, что формирование некрозов является защитной реакцией растения и происходит путем индукции соответствующей клеточной системы. Для комбинации 'W. sylvestris - ВТМ" было показано, что за включение (или не включение) системы некротической реакции ответственен белок оболочки, и даже одиночные аминокислотные замены в белке штамма U1 могут вызывать переход от системной реакции к некротической.
Сравнительно недавно на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова был выделен и охарактеризован новый мутант ВТМ по белку оболочки, вызывающий некротическую реакцию на растениях N. sylvestris. Было показано, что белок оболочки этого мутанта несет две аминокислотные замены (изолейцин-21 -» треонин и аспарагиновая кислота-66 -» глицин), и что эти замены приводят к уменьшению термостабильности изолированного белка оболочки данного мутанта, который получил название ts21-66. Можно предположить, что указанные замены вызывают изменения пространственной структуры белка оболочки ВТМ, которые являются причиной с одной стороны температурной чувствительности мутантного вируса (и препаратов его белка оболочки), а с другой - причиной некротической реакции на заражение этим вирусом растений-хозяев, несущих ген N'. Таким образом, этот мутант и его белок оболочки представляют собой удобную модель для идентификации конкретных элементов структуры, вовлеченных во взаимодействие с системой некротической реакции.
Пространственная организация вируса табачной мозаики достаточно хорошо изучена. Структура вируса дикого штамма U1 определена методом дифракции рентгеновских лучей на ориентированных нитях вирионов с разрешением 2.9 А. Кроме того, с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.4 А определена структура четырехслойного дискового агрегата белка оболочки ВТМ U1. Также ранее методом тритиевой илаииграфии была изучена топография доступной поверхности белка оболочки ВТМ U1 в составе вирионов, и полученные результаты хорошо согласовались с данными рентгеноструктурного анализа. Для мутанта ts21-66 данных рентгеноструктурного анализа нет, и их получение представляется пока малореальной задачей. Таким образом, при наличии данных рентгеноструктурного анализа для ВТМ U1 использование возможностей метода тритиевой планиграфии для структурных исследований может позволить выявить изменения структуры в белке оболочки мутанта ts21-66 по сравнению с диким штаммом ВТМ U1.
Цель настоящей работы - обнаружение методом тритиевой планиграфии различий в пространственной организации субъединиц белка оболочки дикого штамма вируса табачной мозаики U1, вызывающего системную инфекцию на растениях, несущих ген устойчивости N', и его температурно-чувствительного мутанта ts21-66, вызывающего на таких растениях некротическую реакцию.
Объекты исследования - белок оболочки и цельные вирионы дикого вируса табачной мозаики U1 и мутанта ts21-66. Белок оболочки и дикого, и мутантного штамма состоит из 158 аминокислотных остатков, при этом мутантный белок отличается от дикого двумя аминокислотными заменами: изолейцин-21 треонин и аспарагиновая кислота-66 -> глицин.
Для проведения структурных исследований вируса табачной мозаики методом тритиевой планиграфии нам потребовалось провести ряд модельных экспериментов с целью оптимизации условий введения тритиевой метки и параметров системы анализа меченых препаратов.
Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:
1. Впервые для измерения радиоактивности меченных тритием аминокислот в элюате с аминокислотного анализатора Amino Acid Analyzer 835 (Hitachi, Япония) использован проточный сцинтилляционный счетчик Radiomatic 150TR Flow Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co, США). Разработана методика проточного измерения радиоактивности, определены оптимальные параметры системы анализа. Использование проточного счетчика позволило существенно повысить точность и воспроизводимость анализов.
2. Оптимизированы условий введения тритиевой метки в препараты, исследуемые методом тритиевой планиграфии. Изучено влияние времени мечения и давления молекулярного трития в системе на эффективность включения трития в смеси аминокислот и в вирионы вируса табачной мозаики. Показано, что максимальная контрастность при определении поверхностных участков исследуемых данным методом мишеней в использовавшейся системе введения метки достигается при проведении атомизации трития в течение не более 1 мин и давлении молекулярного трития 0.5 Па.
3. Впервые метод тритиевой планиграфии использован для сравнения структуры близких надмолекулярных объектов. Для дикого ВТМ (штамм U1) и его температуро-чувствительного мутанта (ts21-66), отличающегося по симптомам инфекции на определенных типах растений-хозяев, получены распределения тритиевой метки по полипептидной цепи белка оболочки, подвергнутого бомбардировке атомарным тритием как в свободном виде, так и в составе цельных вирионов.
4. При сравнительном анализе включения тритиевой метки в полипептидную цепь белка оболочки для свободного белка значимых различий между штаммом U1 и мутантом ts21-66 не обнаружено, а в вирионах наблюдалось двукратное уменьшение включения метки в N-концевую область белка оболочки мутанта ts21-66 по сравнению с соответствующей областью белка оболочки штамма U1.
5. Предложена модель механизма участия N-концевого сегмента молекулы белка оболочки ВТМ в определении симптомов вирусной инфекции, согласно которой этот сегмент отвечает за ингибирование вирионами (или спиральными агрегатами белка оболочки) штамма U1 N' защитной системы растений. Маскировка данного участка у мутанта ts21-66 приводит к развитию защитного ответа и подавлению вирусной инфекции.
Практическая значимость работы:
Результаты модельных экспериментов и апробации выбранных условий введения радиоактивной тритиевой метки и анализа ее внутримолекулярного распределения на исследованных в работе объектах могут быть широко использованы при решении ряда задач в физико-химической и молекулярной биологии для структурных исследований биологических систем методом тритиевой планиграфии.
Изучение действия различных патогенных организмов на их хозяев является одной из основных задач биологии. Результаты настоящей работы проливают свет на молекулярные механизмы защиты растений от вирусной инфекции и механизмы, используемые вирусами для преодоления этих защитных систем. Расшифровка таких механизмов необходима для разработки эффективных методов борьбы с вирусными инфекциями.
Результаты, полученные в настоящей работе, нашли отражение в курсах лекций "Методы получения меченых органических соединений", "Жидкостно-сцинтилляционный метод измерения радиоактивности", "Радиохимические методы исследования в биохимии и молекулярной биологии", читаемых на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Кроме того, результаты работы используются при постановке задач специализированного практикума "Физико-химические методы анализа белков и нуклеиновых кислот".
Апробация работы. Результаты работы доложены на 3-ей Международной конференции по изотопам (Ванкувер, Канада, 1999 г.), на 7-ом Международном симпозиуме по синтезу и применениям изотопов и изотопно-меченых соединений (Дрезден, Германия, 2000 г.), на 8-ой Международной конференции по проточному анализу (Варшава, Польша, 2000 г.), на 3-ей Российской конференции по радиохимии (Санкт-Петербург, Россия, 2000 г.), на 1-ой Всероссийской молодежной научной конференции по фундаментальным проблемам радиохимии и атомной энергетики (Нижний Новгород, Россия, 2001 г.), на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 98, 99, 2000, 2001, 2002", а так же на научной конференции МГУ "Ломоносовские чтения - 1999".
Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 9 работах, в том числе в 3 статьях в российских научных журналах ("Радиохимия" и "Молекулярная биология") и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.
Вклад автора в разработку проблемы. В основу диссертации положены результаты научных исследований, выполненных непосредственно автором в период 1998-2001 гг. Работа выполнялась в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова на Факультете наук о материалах, в лаборатории радионуклидов и меченых соединений кафедры радиохимии Химического факультета, на кафедре вирусологии Биологического факультета и в отделе хроматографии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Работа проведена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 99-04-48999а и 01-04-06555мас).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 4 таблицами. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов, списка цитируемой литературы, который содержит 142 ссылки, и приложения.