Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биохимия
Аутоантитела к ДНК в сыворотке крови больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом
Диссертация
Автор: Темесген, Балайхун Кибрет
Заглавие: Аутоантитела к ДНК в сыворотке крови больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом
Справка об оригинале: Темесген, Балайхун Кибрет. Аутоантитела к ДНК в сыворотке крови больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04 , 117 c. :
Физическое описание: 117 стр.
Выходные данные: ,
500 руб. |
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Аутоантитела к ДНК
111 Полиреактивность A AT к ДНК
112 Происхождение ААТ к ДНК
113 Каталитическая активность ААТ к ДНК
12 Взаимосвязь вирусных инфекций и аутоиммунитета
121 Индукция аутоиммунных процессов при вирусных инфекциях
122 Аутоантитела к ДНК при вирусных инфекциях
123 Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) краткая характеристика)
124 Изменения в иммунной системе при ГЛПС
125 Циркулирующие иммунные комплексы при ГЛПС
13 Участие иммуноглобулинов М (IgM) в регуляции иммунного ответа
131 Функциональные свойства IgM
132 Роль IgM в регуляции иммунного ответа на вирусные
Инфекции
133 Роль IgM в регуляции аутоиммунного процесса
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
21 Оборудование и реактивы
22 Объект исследования
23 Определение аутоантител к ДНК методом ИФА
231 Подбор оптимальной концентрации конъюгата
232 Статистическая обработка результатов
24 Выделение циркулирующих иммунных комплексов
25 Определение ДНК- абзимной активности в сыворотке крови
26 Выделение и очистка IgG и IgM иммуноглобулинов сыворотки крови
261 Осаждение иммуноглобулинов сульфатом аммония
262 Обессоливание СА-фракции методом гель-фильтрации
263 Хроматография на колонке с QAE-сефадексом А-50
264 Аффинная хроматография A AT к ДНК на нДНК и дДНК-целлюлозе
265 Выделение IgM ААТ к ДНК
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
31 Содержание ААТ к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц
311 Содержание IgG ААТ к ДНК в сыворотке крови при ГЛПС
312 Содержание IgM ААТ к ДНК в сыворотке крови при ГЛПС
313 Зависимость содержания IgG ААТ к ДНК от уровня содержания IgM
32 Характеристика ЦИК в сыворотке крови больных и здоровых лиц
321 Содержание ЦИК в сыворотке крови больных ГЛПС
322 Определение ААТ к ДНК в составе ЦИК
323 Зависимость содержания ААТ к ДНК в ЦИК от уровня их содержания в сыворотке крови больных ГЛПС
33 ДНК-абзимная активность в сыворотке крови больных ГЛПС
331 Определение абзимной активности в сыворотке крови
34 Выделение и характеристика IgG ААТ к ДНК
341 Определение удельной активности IgG ААТ к ДНК
35 Выделение и характеристика IgM ААТ к ДНК
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Аутоантитела к ДНК
111 Полиреактивность A AT к ДНК
112 Происхождение ААТ к ДНК
113 Каталитическая активность ААТ к ДНК
12 Взаимосвязь вирусных инфекций и аутоиммунитета
121 Индукция аутоиммунных процессов при вирусных инфекциях
122 Аутоантитела к ДНК при вирусных инфекциях
123 Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) краткая характеристика)
124 Изменения в иммунной системе при ГЛПС
125 Циркулирующие иммунные комплексы при ГЛПС
13 Участие иммуноглобулинов М (IgM) в регуляции иммунного ответа
131 Функциональные свойства IgM
132 Роль IgM в регуляции иммунного ответа на вирусные
Инфекции
133 Роль IgM в регуляции аутоиммунного процесса
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
21 Оборудование и реактивы
22 Объект исследования
23 Определение аутоантител к ДНК методом ИФА
231 Подбор оптимальной концентрации конъюгата
232 Статистическая обработка результатов
24 Выделение циркулирующих иммунных комплексов
25 Определение ДНК- абзимной активности в сыворотке крови
26 Выделение и очистка IgG и IgM иммуноглобулинов сыворотки крови
261 Осаждение иммуноглобулинов сульфатом аммония
262 Обессоливание СА-фракции методом гель-фильтрации
263 Хроматография на колонке с QAE-сефадексом А-50
264 Аффинная хроматография A AT к ДНК на нДНК и дДНК-целлюлозе
265 Выделение IgM ААТ к ДНК
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
31 Содержание ААТ к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц
311 Содержание IgG ААТ к ДНК в сыворотке крови при ГЛПС
312 Содержание IgM ААТ к ДНК в сыворотке крови при ГЛПС
313 Зависимость содержания IgG ААТ к ДНК от уровня содержания IgM
32 Характеристика ЦИК в сыворотке крови больных и здоровых лиц
321 Содержание ЦИК в сыворотке крови больных ГЛПС
322 Определение ААТ к ДНК в составе ЦИК
323 Зависимость содержания ААТ к ДНК в ЦИК от уровня их содержания в сыворотке крови больных ГЛПС
33 ДНК-абзимная активность в сыворотке крови больных ГЛПС
331 Определение абзимной активности в сыворотке крови
34 Выделение и характеристика IgG ААТ к ДНК
341 Определение удельной активности IgG ААТ к ДНК
35 Выделение и характеристика IgM ААТ к ДНК
Введение:
Актуальность проблемы
По современным представлениям о природе иммунитета основным назначением иммунной системы является защита организма от внешней и внутренней биологической агрессии. Развитие защитной реакции связано со способностью иммунной системы распознавать чужеродные для данного организма макромолекулы и отличать их от собственных антигенов. С другой стороны, известно, что иммунная система в норме обладает потенциальной способностью вырабатывать антитела к большинству собственных антигенов и в сыворотке крови здоровых людей (Добродеева, Суслонова 1990, Несвижский и др., 1988, Lacroix-Desmazes et al., 1998) и интактных животных (Poverenny et al., 1966) всегда присутствует небольшой уровень аутоантител к собственным антигенам. Нарушение механизмов иммунорегуляции может привести к развитию аутоиммунных процессов в организме с повышением содержания в сыворотке крови аутоантител (ААТ) к собственным антигенам организма, что обычно сопровождается патологическими изменениями в различных органах и тканях (Spartz et al., 1997; Christen et al., 2004). Для большинства аутоиммунных заболеваний (АИЗ) характерно повышение содержания в сыворотке крови ААТ к нативной и (или) денатурированной ДНК, что рассматривается как один из диагностических признаков аутоиммунных заболеваний (Arbuckle et al, 2001; Gill et al., 2003; Sherer et al., 2004).
На различных моделях аутоиммунных патологий продемонстрирована возможность активного участия ААТ к ДНК в развитии заболевания (Сучков и др., 2001, Robin et al., 2006). Показано, что ААТ к ДНК проникают в клетки
Koren et al., 1995; Reichlin et al., 1995), перекрестно реагируя с рецепторами клеточной мембраны, способны запускать апоптоз (Paul et al., 2002). Они обладают цитотоксической активностью (Sasaki et al, 1991, Kramers et al., 1994; Nezlin et al., 1999; Kozyr et al., 2002), которая коррелирует с их ДНК-гидролизующей активностью (Сучков и др., 2006). Имеются прямые доказательства повреждающего действия ААТ к ДНК при СКВ на ткань клубочков почек (Morioka, 1996; van Bruggen et al, 1997; Witte et al., 1998; Limaye, Mohan, 2004; Zeng et al., 2004).
В последние годы появились сведения об обнаружении признаков аутоиммунных процессов при вирусных заболеваниях, которые не относятся к АИЗ (Hansen et al., 1998). Повышение содержания в сыворотке крови ААТ к компонентам собственных клеток и тканей, в том числе к ДНК, выявлено в сыворотке крови при вирусном гепатите (Pawlotsky et al., 1994), при ВИЧ (Massabki et al, 1997; Zandman-Goddard, Shoenfeld, 2002), вирусном энцефалите (Гармашова и др., 2004), парвавирусной инфекции (Kerr et al., 1996).
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), вызываемая РНК-содержащими хантавирусами (Raftery, 2002; Miyamoto et.al, 2003; Lednicky, 2003), является одним из опасных, характеризующихся высокой летальностью, вирусных заболеваний. Для ГЛПС характерно поражение многих органов и систем, в особенности почек, вследствие повреждения сосудов микроциркуляторного русла (Сиротин, 1994). Одним из основных факторов повреждения почек при ГЛПС являются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), содержащие, наряду с антителами к вирусу, различные продукты гиперактивации иммунной системы, в том числе аутоантитела к собственным антигенам (Сомова-Исачкова и др., 2003).
В литературе отсутствуют сведения по характеристике спектра аутоантител при ГЛПС, и, неизвестно, присутствуют ли у больных ГЛПС в сыворотке крови и в составе ЦИК ААТ к ДНК. Принимая во внимание данные литературы о повышении уровня содержания ААТ к ДНК при многих вирусных инфекциях, мы предполагаем, что при инфицировании хантавирусами в сыворотке крови больных также могут появиться ААТ к ДНК, которые способны вносить существенный вклад в развитие нефропатии как у больных СКВ (Gaynor et al., 1997, Сучков и др., 2005). Выяснение возможности участия ААТ к ДНК в развитии ГЛПС является одним из подходов для понимания роли ААТ к ДНК при вирусных инфекциях и поиска новых методов лечения.
Цель исследования: выяснить возможность участия аутоантител к нативной и денатурированной ДНК в развитии геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
Были поставлены следующие задачи:
• определить уровень содержания IgG и IgM ААТ к нативной иденатурированной ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц;
• выделить из индивидуальных образцов сыворотки крови больных ГЛПС и здоровых лиц циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и выяснить присутствие в них ААТ к ДНК методом ИФА;
• исследовать ДНК-гидролизующую активность ААТ в сыворотке крови больных ГЛПС;
• выделить из сыворотки крови очищенные фракции IgG и IgM ААТ к ДНК методом аффинной хроматографии на ДНК-сорбентах и определить их удельную ДНК-связывающую активность.
Научная новизна
В работе впервые исследованы ААТ к ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и дана их характеристика.
Во всех исследованных образцах сыворотки крови больных ГЛПС, в отличие от здоровых лиц, выявлена ДНК-абзимная активность, характерная для цитотоксических ААТ к ДНК.
Обнаружено, что уровень содержания ААТ к дДНК в сыворотке крови больных ГЛПС достоверно превышает уровень их содержания в сыворотке крови здоровых лиц.
Установлен ранее неизвестный факт присутствия ААТ к ДНК в ЦИК в сыворотке крови больных ГЛПС.
Практическая значимость
Обнаруженное в работе достоверное повышение уровня содержания ААТ к дДНК в сыворотке крови больных ГЛПС по сравнению с уровнем их содержания у здоровых лиц может иметь важное клинико-диагностическое значение.Присутствие A AT к ДНК в составе ЦИК у больных ГЛПС указывает на то, что эти аутоантитела вовлечены в патогенез заболевания, что необходимо учитывать при выборе стратегии иммунокоррекции при ГЛПС.
Положения, выносимые на защиту:
1 .Установлено, что в сыворотке крови больных ГЛПС присутствуют ААТ к нативной и денатурированной ДНК
2. Выявленные существенные различия уровня содержания и свойств ААТ к ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц, свидетельствуют о потенциальной возможности участия ААТ к ДНК в развитии заболевания.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение».- Казань, 2005; 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».- Пущино, 2005; 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».- Пущино, 2006; X всероссийском научном форуме «Дни иммунологии». - Санкт-Петербург, 2006; а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 2004-2005 гг.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения с 25 рисунками и 10 таблицами, выводов и списка цитируемой литературы с 165 наименованиями.
По современным представлениям о природе иммунитета основным назначением иммунной системы является защита организма от внешней и внутренней биологической агрессии. Развитие защитной реакции связано со способностью иммунной системы распознавать чужеродные для данного организма макромолекулы и отличать их от собственных антигенов. С другой стороны, известно, что иммунная система в норме обладает потенциальной способностью вырабатывать антитела к большинству собственных антигенов и в сыворотке крови здоровых людей (Добродеева, Суслонова 1990, Несвижский и др., 1988, Lacroix-Desmazes et al., 1998) и интактных животных (Poverenny et al., 1966) всегда присутствует небольшой уровень аутоантител к собственным антигенам. Нарушение механизмов иммунорегуляции может привести к развитию аутоиммунных процессов в организме с повышением содержания в сыворотке крови аутоантител (ААТ) к собственным антигенам организма, что обычно сопровождается патологическими изменениями в различных органах и тканях (Spartz et al., 1997; Christen et al., 2004). Для большинства аутоиммунных заболеваний (АИЗ) характерно повышение содержания в сыворотке крови ААТ к нативной и (или) денатурированной ДНК, что рассматривается как один из диагностических признаков аутоиммунных заболеваний (Arbuckle et al, 2001; Gill et al., 2003; Sherer et al., 2004).
На различных моделях аутоиммунных патологий продемонстрирована возможность активного участия ААТ к ДНК в развитии заболевания (Сучков и др., 2001, Robin et al., 2006). Показано, что ААТ к ДНК проникают в клетки
Koren et al., 1995; Reichlin et al., 1995), перекрестно реагируя с рецепторами клеточной мембраны, способны запускать апоптоз (Paul et al., 2002). Они обладают цитотоксической активностью (Sasaki et al, 1991, Kramers et al., 1994; Nezlin et al., 1999; Kozyr et al., 2002), которая коррелирует с их ДНК-гидролизующей активностью (Сучков и др., 2006). Имеются прямые доказательства повреждающего действия ААТ к ДНК при СКВ на ткань клубочков почек (Morioka, 1996; van Bruggen et al, 1997; Witte et al., 1998; Limaye, Mohan, 2004; Zeng et al., 2004).
В последние годы появились сведения об обнаружении признаков аутоиммунных процессов при вирусных заболеваниях, которые не относятся к АИЗ (Hansen et al., 1998). Повышение содержания в сыворотке крови ААТ к компонентам собственных клеток и тканей, в том числе к ДНК, выявлено в сыворотке крови при вирусном гепатите (Pawlotsky et al., 1994), при ВИЧ (Massabki et al, 1997; Zandman-Goddard, Shoenfeld, 2002), вирусном энцефалите (Гармашова и др., 2004), парвавирусной инфекции (Kerr et al., 1996).
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), вызываемая РНК-содержащими хантавирусами (Raftery, 2002; Miyamoto et.al, 2003; Lednicky, 2003), является одним из опасных, характеризующихся высокой летальностью, вирусных заболеваний. Для ГЛПС характерно поражение многих органов и систем, в особенности почек, вследствие повреждения сосудов микроциркуляторного русла (Сиротин, 1994). Одним из основных факторов повреждения почек при ГЛПС являются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), содержащие, наряду с антителами к вирусу, различные продукты гиперактивации иммунной системы, в том числе аутоантитела к собственным антигенам (Сомова-Исачкова и др., 2003).
В литературе отсутствуют сведения по характеристике спектра аутоантител при ГЛПС, и, неизвестно, присутствуют ли у больных ГЛПС в сыворотке крови и в составе ЦИК ААТ к ДНК. Принимая во внимание данные литературы о повышении уровня содержания ААТ к ДНК при многих вирусных инфекциях, мы предполагаем, что при инфицировании хантавирусами в сыворотке крови больных также могут появиться ААТ к ДНК, которые способны вносить существенный вклад в развитие нефропатии как у больных СКВ (Gaynor et al., 1997, Сучков и др., 2005). Выяснение возможности участия ААТ к ДНК в развитии ГЛПС является одним из подходов для понимания роли ААТ к ДНК при вирусных инфекциях и поиска новых методов лечения.
Цель исследования: выяснить возможность участия аутоантител к нативной и денатурированной ДНК в развитии геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
Были поставлены следующие задачи:
• определить уровень содержания IgG и IgM ААТ к нативной иденатурированной ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц;
• выделить из индивидуальных образцов сыворотки крови больных ГЛПС и здоровых лиц циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и выяснить присутствие в них ААТ к ДНК методом ИФА;
• исследовать ДНК-гидролизующую активность ААТ в сыворотке крови больных ГЛПС;
• выделить из сыворотки крови очищенные фракции IgG и IgM ААТ к ДНК методом аффинной хроматографии на ДНК-сорбентах и определить их удельную ДНК-связывающую активность.
Научная новизна
В работе впервые исследованы ААТ к ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и дана их характеристика.
Во всех исследованных образцах сыворотки крови больных ГЛПС, в отличие от здоровых лиц, выявлена ДНК-абзимная активность, характерная для цитотоксических ААТ к ДНК.
Обнаружено, что уровень содержания ААТ к дДНК в сыворотке крови больных ГЛПС достоверно превышает уровень их содержания в сыворотке крови здоровых лиц.
Установлен ранее неизвестный факт присутствия ААТ к ДНК в ЦИК в сыворотке крови больных ГЛПС.
Практическая значимость
Обнаруженное в работе достоверное повышение уровня содержания ААТ к дДНК в сыворотке крови больных ГЛПС по сравнению с уровнем их содержания у здоровых лиц может иметь важное клинико-диагностическое значение.Присутствие A AT к ДНК в составе ЦИК у больных ГЛПС указывает на то, что эти аутоантитела вовлечены в патогенез заболевания, что необходимо учитывать при выборе стратегии иммунокоррекции при ГЛПС.
Положения, выносимые на защиту:
1 .Установлено, что в сыворотке крови больных ГЛПС присутствуют ААТ к нативной и денатурированной ДНК
2. Выявленные существенные различия уровня содержания и свойств ААТ к ДНК в сыворотке крови больных ГЛПС и здоровых лиц, свидетельствуют о потенциальной возможности участия ААТ к ДНК в развитии заболевания.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение».- Казань, 2005; 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».- Пущино, 2005; 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».- Пущино, 2006; X всероссийском научном форуме «Дни иммунологии». - Санкт-Петербург, 2006; а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 2004-2005 гг.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения с 25 рисунками и 10 таблицами, выводов и списка цитируемой литературы с 165 наименованиями.
