Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад

Диссертация

Автор: Сазонова, Олеся Ивановна

Заглавие: Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад

Справка об оригинале: Сазонова, Олеся Ивановна. Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Сазонова Олеся Ивановна; [Место защиты: Ин-т биофизики клетки РАН] - Пущино, 2009 - Количество страниц: 113 с. ил. Пущино, 2009 113 c. :

Физическое описание: 113 стр.

Выходные данные: Пущино, 2009






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
12 САЛИЦИЛАТ - КЛЮЧЕВОЙ ИНТЕРМЕДИАТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДЕГРАДАЦИИ
РЯДА АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
121 Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений
122 Салицилат - промежуточный продукт деградации карбарила
123 Салицилат - ключевой промежуточный продукт микробной деградации нафталина, фенантрена и антрацена
13 БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ
БИОДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА
14 РАЗНООБРАЗИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА У БАКТЕРИЙ
141 Организация генов катаболизма нафталина и салнцилата плазмиды NAH7
142 Генетические системы катаболизма салицилата аналогичные nah-генам плазмиды NAH7
143 nag-Yoabi штаммов-деструкторов нафталина Ralstonia sp штамм U и Polaromonas naphthalenivorans CJ2
144 Гены биодеградации салицилата штамма Polaromonas sp JS666
145 /гу/ьгены Pseudomonas aeruginosa JB2 и Achromobacter xylosoxidans A8
146 Гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingobium и родственных им родов
147 Гены катаболизма салицилата грам - положительной бактерии Streptomyces sp WA46
15 Регуляция генов биодеградации салицилата
Салицилат - индуктор экспрессии некоторых оперонов
16 РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ КАТАБОЛИЧЕСКИХ ОПЕРОНОВ37 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Бактериальные штаммы и плазмиды
22 Питательные среды и условия роста
23 Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
24 Выделение тотальной ДНК бактерий
25 Выделение плазмидной ДНК
26 Приготовление блок-вставок
27 Конъюгациопный перенос плазмид
28 Полимеразная цепная реакция
29 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
210 Электрофорез в агарозном геле
211 Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
212 Мечение ДНК методом рассеянной затравки
213 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах
214 Лигирование ДНК
215 Приготовление компетентных клеток Ecoli
216 Трансформация клеток Ecoli плазмидной ДНК
217 Определение нуклеотидной последовательности ДНК49 '
218 Определение удельных активностей ферментов
219 Выделение тотальной РНК
220 Синтез первой цепи кДНЕС
221 Картирование стартовой точки транскрипции
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
31 Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов салицилата
32 Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата
33 Анализ удельных активностей ферментов биодеградации салицилата
34 Амплификация ключевых генов биодеградации салицилата
35 Поиск последовательностей, отвечающих за утилизацию салицилата, в исследуемых штаммах
36 Анализ генов nahGl штаммов-деструкторов салицилата
37 Изучение экспрессии гена nahGl у исследуемых штаммов
38 Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P putida
39 Анализ генов nahUштаммов-деструкторов салицилата
310 Деградация салицилата штаммом P putida АК5
311 Клонирование генов катаболизма нафталина плазмиды рАК5
312 Клонирование генов катаболизма салицилата плазмиды рАК5
313 Анализ нуклеотидной последовательности генов биодеградации салицилата плазмиды рАК5
4 ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ

Введение:
Актуальность проблемы
Салицилат является широко распространенным в природе соединением, важным звеном метаболизма животных, растений и микроорганизмов. Он служит ключевым интермедиатом в бактериальных путях биодеградации нафталина, фенантрена, антрацена, карбарила и других токсичных и канцерогенных соединений, загрязняющих окружающую среду (Davies and Evans, 1964; Evans et al., 1965; Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). Салицилат также играет важную роль в регуляции экспрессии некоторых бактериальных генов. Многие микроорганизмы способны использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако накопление салицилатов в среде может подавлять рост микроорганизмов. К настоящему времени биохимические пути деградации салицилата у микроорганизмов достаточно хорошо исследованы. Бактерии рода Psendomonas могут утилизировать салицилат двумя способами: во-первых, трансформируя его в катехол с помощью салицилат гидроксилазы с дальнейшим расщеплением последнего по орто- или мета-пути; во-вторых, окисляя его посредством салицилат 5-гидроксилазы в гентизиновую кислоту.
Изучение как биохимических, так и генетических аспектов метаболизма салицилата тесно связано с исследованием системы утилизации его высокомолекулярного предшественника - нафталина. Имеющиеся данные указывают на то, что генетический контроль катаболизма как нафталина, так и салицилата у флуоресцирующих псевдомонад является весьма консервативным. Вероятно, это объясняется тем, что организацию генов деградации салицилата изучали на штаммах-деструкторах нафталина. Кроме того, у этой группы микроорганизмов исследование касалось в основном генов, контролирующих деградацию салицилата по мета-пути расщепления катехола. Несмотря на широкое распространение салицилата в природе разнообразие генетических систем биодеградации данного соединения у штаммов-деструкторов салицилата (но не нафталина) до настоящего времени не изучалось. Штаммы, метаболизирующие только салицилат, могут иметь отличную от деструкторов нафталина организацию катаболических генов и, возможно, другие пути утилизации данного соединения.
Особый интерес представляет изучение менее распространенного среди псевдомонад альтернативного пути деградации салицилата через гентизиновую кислоту.
У флуоресцирующих псевдомонад гены катаболизма различных ароматических углеводородов, в том числе салицилата, могут располагаться на коньюгативных плазмидах большого размера (Yen and Serdar, 1988; Herrick et.al., 1997). Известно, что гены биодеградации могут находиться в составе различных транспозонов (Tsuda and lino, 1990; Bosch et.al., 1999b; Tan, 1999). Транспозонная организация катаболических генов, их расположение на коньюгативных плазмидах способствует распространению биодеградативных признаков как внутри, так и между микробными популяциями и играет ключевую роль в адаптации микробных сообществ к возрастающему загрязнению окружающей среды. Рекомбинация между гомологичными областями может привести к делеции несущественных генов и последовательностей ДНК. В результате образуется структура оперона, наиболее эффективная для транскрипции всего катаболического пути. Исследование разнообразия и распространения генетических систем биодеструкции ароматических углеводородов позволяет понять молекулярные1 механизмы адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками.
Цель и задачи работы
Целью данной работы являлось изучение разнообразия и распространения генетических систем катаболизма салицилата у штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из загрязненных нефтепродуктами почв различных географически удаленных регионов.
В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:
1. Определение субстратной специфичности и генотипический анализ штаммов-деструкторов салицилата бактерий рода Pseudomonas изолированных из образцов почв, загрязненных нефтепродуктами.
2. Определение путей биодеградации салицилата вновь изолированными штаммами-деструкторами.
3. Исследование разнообразия генов салицилат 1-монооксигеназы, ключевого фермента биодеградации салицилата.
4. Изучение генетического контроля деградации салицилата штаммом Р. putida АК5, метаболизирующим данное соединение через гентизнновую кислоту.
Научная новизна
В настоящей работе проведен анализ генетических систем деградации салицилата 16 штаммов P. putida, изолированных из загрязненных почв различных географических регионов.
Подобраны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов салицилат гидроксилаз, nahGl и nahU, негомологичных «классическим». Впервые изучено разнообразие данных генов, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahGl и один новый вариант гена nahU. Исследованы штаммы, содержащие несколько негомологичных друг другу последовательностей, кодирующих салицилат гидроксилазу.
Изучена организация генов катаболизма нафталина и салицилата штамма P.putida АК5, утилизирующего нафталин через салицилат и гентнзиновую кислоту. Исследована организация нового, не описанного ранее, .sgp-оперона, контролирующего деградацию салицилата в данном штамме.
Практическая значимость работы
Результаты, полученные в настоящей работе, представляют интерес как с фундаментальной точки зрения, так и имеют практическое применение.
Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить представления о молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению ксенобиотиками, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов.
Специфические праймеры для детекции генов салицилат гидроксилаз, подобранные в ходе данной работы, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве. Подобранные праймеры, наряду с праймерами для детекции других ключевых генов биодеградации ароматических углеводородов (например, гена большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы - nahAc и катехол 2,3-дноксигеназы - nahH) можно использовать для создания ПЦР тест - систем для более точной оценки биодеградативного потенциала загрязненной территории. Поскольку полученные данные свидетельствуют о большей каталитической активности салицилат гидроксилазы NahU по сравнению с «классическими» салицилат гидроксилазами NahG, этот факт следует учитывать при выборе штаммов, используемых в биотехнологиях очистки окружающей среды.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB, Leipzig, 2006; Российская школа-конференция молодых ученых «Экотокснкология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», 2006; международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. 2006; Российская школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию создания института ГосНИИгенетика, 2008.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц и 32 рисунка. Библиография включает 181 наименования, из них 8 отечественных и 173 зарубежных работ.