Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов

Диссертация

Автор: Ажикина, Татьяна Леодоровна

Заглавие: Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов

Справка об оригинале: Ажикина, Татьяна Леодоровна. Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.03 / Ажикина Татьяна Леодоровна; [Место защиты: Институт биоорганической химии РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 210 с. ил. Москва, 2009 210 c. :

Физическое описание: 210 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

Список сокращений
1 Введение
2 Обзор литературы "Этапы развития сравнительных гибридизационных методов и их место в современных структурно-функциональных исследованиях геномов и транскриптомов"
21 Вычитающая гибридизация - принцип метода
22 Вычитающая гибридизация без применения ПЦР
23 Вычитающая гибридизация с использованием ПЦР
24 Representational Differential Analysis и современное искусство вычитания
241 RDA - проблемы и пути их решения
242 Применение RDA в геномных сравнениях
243 Применение RDA для сравнения кДНК
244 Метил-чувствительный репрезентативный дифференциальный анализ (MS-RDA)
245 Направления усовершенствования RDA
246 Разделение фрагментированных геномов по длине - метод упрощения геномов
25 In Gel Competitive Reassociation - 1GCR "
26 Эпоха ПЦР-супрессии
261 Вычитающая гибридизация кДНК (Suppressive Subtractive
Hybridization, SSH)
262 Вычитающая гибридизация геномных ДНК
263 Нормализация и истощение библиотек кДНК
264 Coincidence cloning 42 27 Заключение
3 Материалы и методы
31 Стандартные методики
32 Ткани, клеточные линии, штаммы, космиды
33 Компьютерный анализ
34 Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма штаммов
М tuberculosis
35 Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма байкальских сиговых
36 Методы, используемые при изучении метилирования локуса
FXYD5-COX7A1 (Chr 19)
37 Методы, используемые для получения набора последовательностей Мtuberculosis, транскрибирующихся в легком мыши
38 Методы, используемые при изучении олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице
4 Результаты и обсуждение
41 Вычитающая гибридизация близкородственных геномов
411 ПДРФ-вычитающая гибридизация
412 Полногеномное сравнение различных штаммов Mtuberculosis
413 Геномное сравнение близкородственных видов байкальских сиговых
42 Метод клонирования идентичных последовательностей 104 421Метод клонирования идентичных последовательностей для анализа тканеспецифического метилирования протяженных геномных локусов 105 422 Rapid Identification of Genomic Splits
423 Распределение неметилированных сайтов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 в нормальной и опухолевой тканях легкого, а также клеточной линии А
424 Анализ бактериального транскриптома внутриклеточных патогенов in vivo
43 Использование олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице как зондов в молекулярной биологии
431 Комбинации SBO в качестве объединенных праймеров для секвенирования
432 Использование модифициролванных олигонуклеотидов в ПЦР 150 433Использование модифицированных олигонуклеотидов в RAPD
5 Выводы

Введение:
Структурно-функциональные и сравнительные исследования геномов по-прежнему остаются основой молекулярной биологии и генетики. Все методы таких исследований условно подразделяют на две большие группы: методы прямого секвенирования и методы несеквенирующего сравнительного анализа. Современное секвенирование включает серию высокотехнологичных масштабных методов, позволяющих определять в короткие сроки последовательности десятков и сотен миллионов нуклеотидов. Однако полностью решить проблемы полногеномного исследования только прямым секвенированием вряд ли возможно, поскольку в геномах (особенно эукариотических) имеются локусы, недоступные для клонирования, определения первичной структуры ДНК или однозначной реконструкции протяженных фрагментов из-за наличия большого числа гомопоследовательностей, GC-богатых участков и/или повторов. Так, например, в «окончательном» варианте генома человека, опубликованном International Human Genome Sequencing Consortium в 2004г., оставалось более чем 340 участков, для которых не была определена первичная структура. Кроме того, полногеномное секвенирование остается очень дорогим методом, и всестороннее изучение громадной геномной вариабельности посредством секвенирования с точки зрения материальных затрат в настоящее время и в обозримом будущем нереально.
Методы, относящиеся ко второй группе, основанные на использовании свойства ДНК образовывать устойчивые двухцепочечные структуры из комплементарных одноцепочечных молекул, получили название гибридизационных. Среди гибридизационных подходов в частности активно используются различные виды микроэрреев, позволяющие в значительной степени интенсифицировать исследования при снижении временных и стоимостных затрат. Несмотря на широкое распространение в мире и успешное применение для решения самых разнообразных задач геномики, микроэррейные технологии имеют серьезные недостатки: недостаточная специфичность гибридизации на твердой подложке, а также большое количество ложнопозитивных сигналов, возникающих при взаимодействии повторяющихся элементов генома, семейств генов и других неоднозначных участков, проблемы при анализе транскрибирумых на низком уровне кДНК и сложности с дискриминацией различных вариантов сплайсинга. Существенным ограничением метода является обязательность знания нуклеотидной последовательности геномастандарта, без чего невозможно сконструировать микроэррей, а в сравниваемых со стандартом исследуемых геномах невозможно детектировать последовательности, присутствующие в исследуемом геноме, но отсутствующие в стандарте.
Преимущества гибридизации в растворе перед гибридизацией на твердом носителе основаны на преимуществах кинетики второго порядка, а также возможности выделения продуктов гибридизации из смеси для последующего анализа или же проведения дополнительного раунда гибридизации, что существенно увеличивает эффективность процедуры. Методы дифференциального гибридизационного анализа геномов и продуктов их экспрессии можно классифицировать по конечному результату, который они позволяют получить, на (i) методы описательного анализа фрагментов различий сравниваемых объектов (геномов или отдельных участков геномов) и (и) методы физического выделения дифференциальных фрагментов.
К описательным методам относят методы анализа различий определенных геномных локусов, например, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) (Pearson, 1985) и методы полногеномного анализа (геномная дактилоскопия (DNA fingerprinting) (Tautz, 1990); ПЦР с произвольно выбранными праймерами (RAPD) (Welsh and McClelland, 1990), (Johnson et al., 1994); кросс-гибридизация (cross-hybridizing) (Gershon et al., 1989).
К группе методов, нацеленных на физическое выделение фрагментов ДНК, содержащих различия между геномами, можно отнести дифференциальный дисплей (для обзора cM.(Broude, 2002)) и методы, объединенные общим названием «вычитающая гибридизация». Методы этой группы дают возможность прямого получения библиотек различий сравниваемых геномов или продуктов их экспрессии, поэтому в результате их использования возможно быстрое получение структурной информации о различиях между объектами и ее использование для дальнейшего функционального анализа.
Таким образом, по-прежнему актуальными являются разработка и совершенствование гибридизационных методов анализа геномов, которые могли бы расширить возможности уже существующих методов, в частности, позволили бы с с высокой эффективностью идентифицировать дифференциальные последовательности геномных ДНК и характерные особенности сравниваемых транскриптомов.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Этапы развития сравнительных гибридизационных методов и их место в современных структурно-функциональных исследованиях геномов и транскриптомов
В обзоре литературы автор ограничивается рассмотрением метода вычитающей гибридизации, его основных принципов, этапов развития, места в современной сравнительной геномике. Исчерпывающий обзор литературы по этим вопросам малореален из-за огромного и постоянно растущего объема публикаций, поэтому особое внимание будет уделено наиболее ярким модификациям и приложениям этого метода.