Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML

Диссертация

Автор: Вайшля, Наталья Аркадьевна

Заглавие: Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML

Справка об оригинале: Вайшля, Наталья Аркадьевна. Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Вайшля Наталья Аркадьевна; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 100 с. ил. Москва, 2009 100 c. :

Физическое описание: 100 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Апоптоз - запрограммированная клеточная смерть
211 Молекулярные механизмы апоптоза
Каспазы
Семейство белков Bcl-2
212 Внешний путь развития апоптоза
213 Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза
22 Ингибиторы апоптоза
23 Сурвивин
231 Структура сурвивина
232 Экспрессия гена BIRC5
233 Биологические активности сурвивина
Ингибирование апоптоза
Роль сурвивина в митотическом делении клетки
Влияние сурвивина на ангиогенез
24 PML - (promyelocytic leukemia gene - ген промиелоцитарной лейкемии)
241 Структура гена PML и классификация изоформ мРНК
242 Доменная структура белка PML, характеристика его изоформ и компартментализации в клетке
243 Экспрессия гена PML
244 Биологические активности PML
PML —регулятор экспрессии генов
Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML
Противовирусная активность PML
25 SMAC/DIABLO (Second Mitohondria-derived Activator of Caspases)
251 Структура SMAC/DIABLO
252 Экспрессия гена SMAC/DIABLO
253 Проапоптотическая активность SMAC/DIABLO

Введение:
4.2. Анализ экспрессии гена BIRC5 и генов его ингибиторов SMAC и PML.58
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях человека при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода.58
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека.66
4.2. Создание экспрессионных генно-инженерных конструкций, содержащих гены SMAC и PML.69
4.3. Получение клеточных линий А549, HeLa, Calul и NCI-H358, стабильно экспрессирующих SMAC и PML.72
4.4. Анализ эффекта экспрессии гена PML в условиях транзиентной трансфекции клеток линий HeLa, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-N1-PML1 75
4.5. Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5.78
4.6 Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358.80
4.7 Анализ влияния стабильной экспрессии гена SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358.82
4.8. Заключение.84
5. ВЫВОДЫ .86
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.87
БЛАГОДАРНОСТИ. 100
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ п.н. - пар нуклеотидов ед. — единица об/мин — оборотов в минуту ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК-аза I - дезоксирибонуклеаза I
BIR - baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains, повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза
BIRC5 - baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin), белок, содержащий повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза PML — promyelocyte leukaemia, ген промиелоцитарной лейкемии
SMAC/DIABLO - second mitohondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi, второй митохондриальный активатор каспаз/связывающийся с ингибиторами апоптоза белок с низким значением изоэлектрической точки
IAP — inhibitors of apoptosis proteins, белки ингибиторы апоптоза
XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis, ассоциированный с X хромосомой ингибитор апоптоза
RING — Really Interesting New Gene
RAR-a — receptor a-retinoic acid, рецептор а-ретиноевой кислоты PML-NB - PML nuclear body, PML ядерное тельце CARD — caspase recruitment domain, домен рекрутирующий каспазы RBCC/TRIM - RING-B-Coiled-Coil/TRIpartite Motif
МНС I - major histocompatibility complex I, главный комплекс гистосовместимости I
HDAC — гистондеацетилаза
ОПЛ — острый промиелоцитарный лейкоз
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
GFP — green fluorescence protein, зелёный флуоресцентный белок
NF-kB - nuclear factor kappa-B, ядерный фактор к В
NLS - nuclear localisation signal, сигнал ядерной локализации
NES - nuclear export signal, сигнал ядерного экспорта
Taq ДНК-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus
ДТТ — дитиотриэтол
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота кДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК рРНК - рибосомная РНК кДа - килоДальтон
ОТ - обратная транскрипция
ПААГ - полиакриламидный гель
ТЕМЕД - тетраэтиленметилендиамин
X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-Б-галактопиранозид
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат
SV40 - simian virus 40, обезьяний вирус 40
BRUCE - BIR Repeat Containing Ubiquitin-conjugating Enzyme, коньюгированный с убиквитином белок, содержащий BIR-домен c-IAP - cellular inhibitor of apoptosis protein 1, клеточный ингибитор апоптоза NAIP - Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein, нейрональный белок, ингибирующий апоптоз
TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли
VEGF - vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты
HMPJI — немелкоклеточный рак легкого
АК - аденокарцинома
ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПРП - плоскоклеточный рак пищевода
IgG - иммуноглобулин G
INF - интерферон
ISRE - INF-a и —/З-stimulated response element GAS - INF-^-activation site DISC - death-inducing signalling complex PARP - поли-АДФ-рибоза-полимераза
1. ВВЕДЕНИЕ
Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (IAP, Inhibitor of Apoptosis Protein) [1]. Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза.
Ген BIRC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей [1].
Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ингибирующее действие по отношению к каспазам [2].
Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia) [3]. PML - многофункциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом [4]. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связан с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют [3].
Таким образом, на основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка [5-7], и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC [8, 9]. Способность подавлять активность промотора BIRC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучена лишь в двух работах и показана только для одной изоформы PML, PML6 [3, 10].
Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами пемелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект. Цель работы
Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Онкологические заболевания являются одной из важнейших причин смертности в мире и их число с каждым годом растет. Нарушение процесса программируемой клеточной гибели, или апоптоза, играет ключевую роль в прогрессии злокачественных опухолей. Процесс апоптоза контролируется большим числом индукторов и ингибиторов [11]. Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз [12]. Сурвивин (BIRC5) - уникальный белок семейства IAP, который участвует в трёх клеточных процессах (ангиогенез, клеточное деление и процесс апоптоза) и экспрессируется на повышенном уровне практически при всех типах рака [1]. SMAC и PML - природные ингибиторы сурвивина [2, 3], которые могут быть использованы для подавления сурвивина в опухолевых клетках.