Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Радиобиология

Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих

Диссертация

Автор: Лизунова, Екатерина Юрьевна

Заглавие: Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих

Справка об оригинале: Лизунова, Екатерина Юрьевна. Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.01 / Лизунова Екатерина Юрьевна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова. Биол. фак.] - Москва, 2009 - Количество страниц: 98 с. ил. Москва, 2009 98 c. :

Физическое описание: 98 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

Введение
1 Обзор литературы
11 Факторы, определяющие чувствительность клеток к воздействию ионизирующего излучения
12 Изменения клеточной радиочувствительности после облучения в малых дозах
2Материалы и методы
Лимфоциты крови: выделение, условия культивирования и облучения
Культура клеток: условия культивирования и облучения
Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала
Метод электрофореза ДНК единичных клеток
Анализ доли клеток с высоким содержанием фосфорилированного гистона
Оценка доли погибших клеток
Статистический анализ полученных данных
3 Результаты исследований и их обсуждение
31Индукция двунитевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в делящихся лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе
32Изменения поврежденности генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях облученных клеток линии СНО
33Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и клеток селезенки мышей в течение хронического облучения

Введение:
Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению (адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствительность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill, Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем аптиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Seoane et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой па протяжении многих поколений возникают de novo аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001, 2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической системы (формирование гипервариабельных участков парагопа антител, появление альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее актуальных задач радиационной биологии.
В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные' пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеипкиназа С (РКС), р38 митоген-активируемая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 81, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения о том, в ответ па какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика па облучение. Среди повреждений ДНК, вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных клеток к тестирующему облучению: предотвращения образования ДР ДНК или активизации процессов репарации ДНК от них? В течение скольких поколений облученных клеток сохраняется чувствительность/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется?
Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденности ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных поколениях облученных клеток млекопитающих.
В работе использовали лимфоциты крови человека, эпителиальные клетки яичника китайского хомячка линии СНО, а также лейкоциты крови и клетки селезенки мышей линии СВА/lac. Выбор столь разных экспериментальных обьектов обусловлен их уникальными возможностями. В отличие от лимфоцитов грызунов, свсжевыделенные лимфоциты периферической крови человека легко стимулируются к делению фитогемоагглютинином. Высокая чувствительность к облучению, известный кариотип и возможность их культивирования in vitro в течение 5-6 суток (без усложнения методики) сделали лимфоциты крови человека одним из наиболее распространенных объектов для изучения механизмов адаптивного ответа (АО) (Пелевина и др., 2000, 2003, 2007, 2009). Недостатком этого объекта является относительно короткий срок культивирования и довольно высокая вариабельность показателей в зависимости от конкретного донора. Для оценки эффектов облучения в отдаленных потомках облученных клеток нами была использована культура клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Ранее именно на этой культуре клеток была показана индукция нестабильности генома в потомках облученных клеток (Антощина и др. 2005). Для изучения биологических эффектов хронического облучения клеток млекопитающих in vivo нами были выбраны линейные мыши CBA/lac, характеризующиеся высокой чувствительностью к хроническому облучению и низким уровнем спонтанных хромосомных нарушений (Blandova, 1983). Использование общего методического подхода для оценки изменений радиочувствительности ДНК делает возможным включение экспериментальных результатов, полученных на вышеупомянутых биообъектах, в диссертационную работу.
Цель и задачи исследования Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР Д11К, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
• Исследовать изменения выхода и эффективности репарации ДНК от ДР, индуцированных тестирующим облучением в проявляющей дозе в адаптированных облучением в малой дозе и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.
Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток эпителия яичника китайского хомячка линии СНО.
• Изучить изменения выхода ДР ДНК, индуцированных облучением в проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Адаптивный ответ, вызванный в стимулированных к делению лимфоцитах крови облучением в малой дозе (5 сГр), сохраняется в их кратковременной культуре, по крайней мере, в течение 72 ч ( 3 митоза) после его индукции, переходя от материнских клеток в поколения дочерних
2. Поврежденность ДНК, обусловленная двунитевыми разрывами ее молекул в клетках СНО в результате облучения в сублетальной дозе, проявляется в потомстве этих клеток длительное время, на протяжении многих поколений, такими же разрывами, свидетельствуя о возникновении и поддержании, по крайней мере, в части их, радиационно-индуцированной нестабильности генома и создавая условия для селекции из них клеток-родоначальников радиорезистентных клонов
3. При хроническом воздействии у-излучения на клетки млекопитающих в зависимости от времени облучения и ог накопленной дозы реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные со снижением степени фрагментации ДНК в клеточных популяциях.
Научная новизна. Впервые с помощью метода ДНК-комет были проведены исследования изменений чувствительности адаптированных облучением в малой дозе лимфоцитов периферической крови человека к индукции ДР ДНК облучением в тестирующей дозе, а также эффективности их репарации в течение 72 ч (время трех митозов) после индукции АО. Впервые исследованы изменения степени поврежденности генома и чувствительности к дополнительному облучению в 37-42-х поколениях, облученных в дозе 1 Гр. эпителиальных клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Получены новые результаты, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые показано, что при хроническом "воздействии у-излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации-ДНК в клеточной популяции.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии при изучении механизмов возникновения и поддержания нестабильности генома, изменения радиочувствительности клеточных популяций в пострадиационном периоде, эффектов формирования отдаленных последствий облучения на клеточном уровне. Результаты исследований хронически облученных мышей будут весьма полезны при проведении радиоэкологического мониторинга окружающей среды, а в космической биологии и в медицине для оценки эффектов хронического облучения в малых дозах.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008) и 36-м ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (Tours, France, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ