Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биоинформатика

Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA

Диссертация

Автор: Степанова, Екатерина Викторовна

Заглавие: Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA

Справка об оригинале: Степанова, Екатерина Викторовна. Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.28 / Степанова Екатерина Викторовна; [Место защиты: Ин-т проблем передачи информации РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 132 с. ил. Москва, 2009 132 c. :

Физическое описание: 132 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

I Литературный обзор
Введение
11 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот
12 Транскрипционные факторы GreA и GreB
13 Регуляция факторами, взаимодействующими с РНКП через 27 вторичный канал
Структура и функции эукариотического аналога Gre — 27 транскрипционного фактора TFIIS
Структура и функции транскрипционного фактора Gfhl — 32 гомолога Gre
Структура и функции транскрипционного фактора DksA
Структура и функции транскрипционного фактора Rnk
Структура и функции транскрипционного фактора TraR

Введение:
В настоящее время интенсивно изучаются механизмы регуляции транскрипции, основанные на модуляции каталитической активности РНК-полимеразы (РНКП). Большой интерес вызывают молекулярные механизмы действия факторов, связывающихся во вторичном канале РНКП (Рис.1). Число известных факторов этой группы постоянно растет. К ним относятся как гомологичные, так и неродственные белки со сходной пространственной организацией, которая приспособлена для связывания с ферментом. К настоящему моменту известны следующие факторы этого класса: транскрипт-расщепляющие факторы семейства вге [1, 2], обнаруженные почти во всех эубактериях; ингибитор транскрипции ОЙ11 [3], обнаруженный в микроорганизмах группы Ветососси8-Ткегти8\ глобальный регулятор системы строгого контроля ЭкзА [4, 5], осуществляющий регуляцию кооперативно с алармоном ррОрр; недавно открытый глобальный регулятор ТгаЯ [6], последовательность которого кодируется на ДНК конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, а также фактор Япк [7].
Несмотря на обилие имеющейся информации, представления о факторах, действующих через вторичный канал, все еще остаются неполными: для некоторых из них отсутствуют структурные данные (ТгаЯ), для других остается невыясненным механизм связывания и регуляции активности РНКП (ЭкзА, ТгаК, Кпк), для третьих - не до конца установлена их биологическая роль в клетке (вгеА, ОгеВ, вШ, Япк). Очевидно, однако, что регуляция транскрипции через вторичный канал РНКП — это один из важных, эволюционно консервативных механизмов клеточной регуляции.
1.1 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот
ДНК-зависимая РНК-полимераза - главный фермент транскрипции в клетке, который ответственен за синтез цепи РНК, комплементарной транскрибируемой цепи ДНК-матрицы, в присутствии субстратов -рибонуклеозид-5'-трифосфатов. Мультисубъединичные РНКП эукариот, архебактерий и эубактерий гомологичны друг другу [8]. Каталитически активный кор-фермент РНКП большинства эубактерий состоит из 5 (агрр'ш) субъединиц: двух а (-36 кДа), р (-150 кДа), р' (-155 кДа) и со (-8,5 кДа) и имеет общий молекулярный вес, равный —380 кДа. Для специфической инициации транскрипции с определённой позиции ДНК-матрицы кор-фермент должен связаться с одним из факторов специфичности о (или а-субъединицей, -20-70 кДа) с образованием холо-фермента РНКП (агрр'соа) [8-12].
Структуру РНКП можно описать как глобулу эллипсоидальной формы с глубоким вырезом посередине молекулы, что придает ей сходство с клешней краба. Основанием «клешни» является димер а-субъединиц, взаимодействующие с ним участки р и р' и каталитический центр. Основная белковая масса Р и р' субъединиц образует своеобразные «зажимы», полость между которыми служит для связывания ДНК-матрицы и РНК-продукта. Удобно выделить передний и задний края фермента, взяв за основу направление движения РНКП вдоль молекулы ДНК. Соответственно, ДНК-дуплекс, входящий в полость фермента, будет называться передним, а выходящий — задним (Рис.1). Передняя часть полости разделена перегородкой на два канала: большой первичный и малый вторичный каналы [8-12].
Первичный канал (Рис. 1) служит для связывания входящего ДНК-дуплекса (длиной -15-20 пн), транскрипционного пузыря (участка ДНК длиной 12-14 пн, где происходит плавление ДНК-дуплекса) и ДНК-РНК-гетеродуплекса (длиной в 9±1 нт) (Рис.1) [13]. Для предотвращения схлопывания транскрипционного пузыря нематричная цепь удерживается элементами зажима ?, а матричная цепь ДНК направляется элементами субъединицы ?' к каталитическому центру. Каталитический центр РНКП встроен в стенку первичного канала. Он образован консервативным мотивом ?'-субъединицы NADFDGD. Три остатка Asp этого мотива (у Е. coli — Asp
0-4739, Asp-741 и Asp-743) хелатируют первый ион Mg I, необходимый для катализа. Эти остатки вместе с кислыми остатками ?-субъединицы (у Е. coli —
Glu-685 и Asp-686) также участвуют в хелатировании второго pi. каталитического иона Mg И [9, 11, 13]. ДНК-РНК-гетеродуплекс берёт своё начало от каталитического центра и, проходя по стенке первичного канала, заканчивается в задней части фермента, на перегородке, разделяющей ДНК и
РНК. Выходя из ДНК-РНК-гетеродуплекса, 5'-концевой одноцепочечный участок транскрипта (длиной в 6 нт) поступает в канал выхода РНК. После
разделения РНК-ДНК-гетеродуплекса верхняя часть матричной цепи ДНК восстанавливает дуплекс с нематричной цепью ДНК и свободно покидает первичный канал, не вступая в дальнейшее взаимодействие с РНКП [9, 13].
Вторичный канал имеет форму воронки (Рис.1). Широкое отверстие воронки открывается на передней поверхности РНКП. Постепенно сужаясь, вторичный канал проходит внутрь фермента, и его малое отверстие открывается рядом с каталитическим центром. В нижней части полость вторичного канала отделена от первичного канала перегородкой, состоящей из элементов ?З'Е-мост и ?З'О-петля [9, 13]. Через вторичный канал в каталитический центр поступают субстраты, и происходит диссоциация 3'-концевого фрагмента РНК в обратно-смещенных комплексах (см. ниже). Вторичный канал также служит сайтом связывания транскрипционных факторов, рассмотренных в данном обзоре.
Транскрипция представляет собой циклический процесс, который можно разделить на три стадии: связывание РНКП промоторной ДНК и инициация синтеза РНК; процессивная элонгация цепи РНК; и терминация синтеза и диссоциация конечного продукта (полноразмерного РНК-транскрипта).
РНКП начинает новый транскрипционный цикл в виде холофермента, включающего а-субъединицу [9, 14, 15]. С ее помощью происходит узнавание и связывание промоторной последовательности ДНК. Для узнавания некоторых промоторов также необходимо участие а-субъединицы [16, 17]. После плавления ДНК-дуплекса в районе точки старта транскрипции и формирования транскрипционного пузыря начинается синтез РНК. Перед тем, как РНКП начнет процессивную элонгацию, фермент проходит стадию первичного, т.н. абортивного, синтеза транскрипта [9, 18].
Рис. 1.1 Эпонгационный комплекс (ЭК) РНКП. На рисунке схематически показано устройство ЭК, вид со стороны первичного канала. В полости первичного канала РНКП располагается каталитический центр (консервативный мотив ИАВРООО - тонкой линией, его аминокислоты хелатируют ионы М02+ I и Мц2+ II, изображенные серыми сферами), транскрипционный пузырь и ДНК-РНК-гетеродуплекс, в котором РНК изображена толстой прерывистой черной линией. Вблизи от каталитического центра открывается воронка вторичного капала (изображен как желоб серого цвета), которая отделена от первичного канала элементами рТ-мост и [З'О-петля. Передний ДНК-дуплекс связывается элементом РНКП передний ДНК связывающей зажим. Матричная цепь ДНК изображена черной толстой линией, нематричная цепь ДНК - серой. В задней части фермента расположен канал выхода РНК. В канале выхода РНК располагается эвакуируемый одноцепочсчный РПК-продукт.
На начальной стадии абортивного синтеза транскрипта кор-фермент сохраняет контакты с ст-субъединицей, а ст-субъединица - с промоторной последовательностью ДНК. В ходе синтеза, двигаясь вперёд относительно матрицы, РНКП, по-видимому, втягивает транскрибируемый участок двухцепочечной ДНК внутрь, а расплетенные одноцепочечные участки, вероятно, выпетливаются наружу. Этот процесс, т.н. сжатие (scrunching), должен сопровождаться внутренней деформацией фермента и ДНК-матрицы [19]. Накапливающееся по мере синтеза РНК упругое напряжение в инициаторном комплексе может являться источником энергии либо для высвобождения абортивного транскрипта, либо для перехода комплекса к стадии элонгации. В случае высвобождения абортивного транскрипта, продукт диссоциирует из комплекса через вторичный канал, РНКП возвращается к позиции старта и повторяет цикл заново. Количество абортивных циклов на разных промоторах может варьировать от десятка до нескольких тысяч, что может приводить к накоплению большого количества абортивных продуктов, а иногда и фактически блокировать синтез полноразмерной РНК [9, 18].
Когда длина транскрипта достигает 7-9 нт, инициаторный комплекс притерпевает существенную конформационную перестройку. В результате, а-субъединица высвобождается, как следствие, разрушается контакт РНКП с промоторной последовательностью ДНК, и фермент переходит к стадии продуктивной элонгации [9, 14]. Элонгационный комплекс (ЭК) обладает высокой стабильностью и процессивностью.
ЭК способен синтезировать РНК размером несколько десятков тысяч нт без диссоциации от ДНК-матрицы и РНК-продукта. На стадии терминации
ЭК распознаёт сигнал, закодированный в особой структуре транскрипта, формируемой в канале выхода РНК, и быстро диссоциирует с высвобождением ДНК-матрицы и РНК-продукта [20]. После этого кор-фермент РНКП оказывается готовым снова присоединить а-субъединицу и начать новый цикл транскрипции.
В процессе элонгации движение РНКП по ДНК-матрице не является непрерывным. Исследование динамики синтеза индивидуальных молекул показывает, что монотонное продвижение вперед чередуется с остановками различной продолжительности [21, 22]. В клетке к образованию пауз могут привести неоптимальные концентрации субстрата, локальные особенности структуры матричной ДНК, влияние транскрипционных факторов и малых молекул-регуляторов, а также спонтанные нарушения в структуре самой РНКП [23-28]. Транскрипционные паузы часто определяют общую скорость транскрипции, играя важную роль в синхронизации процессов транскрипции и трансляции.
В экспериментах по транскрипции in vitro ЭК в состоянии паузы могут быть получены при отсутствии одного из четырех субстратов или за счет создания механического препятствия, например ДНК-связывающего белка, на пути следования РНКП. [28-30]. Как показывают ДНК-футпринты таких «остановленных» комплексов, фермент в них не пребывает в статическом состоянии, а напротив, совершает постоянные осцилляции, перемещаясь вперед-назад вдоль ДНК. При этом РНКП вместе с каталитическим центром может сместиться на несколько (2-20) нт назад относительно З'-конца РНК [29-31]. Способность к смещению комплекса в обратном направлении определяется локальными свойствами ЭК и может резко изменяться при удлинении транскрипта даже на один нуклеотид [32].
Активный ЭК
• Каталитичесхии центр 1 ТТЛ ДНК-матрица - РНК-продукт
CZZI^ рнкп
О Транскрипционный пузырь
Обратное смешение ^ на 2-3 нт
Обратное смещение более чем наЗ нт
Дюинироввннык ЭК
Рис. 1.2 Механизмы образования и преодоления пауз и перманентных остановок транскрипции. Активный ЭК (сверху) содержит транскрипционный пузырь и РНК-продукт, 3'-конец которого находится в каталитическом центре. Обратное смещении па два-три нуклеотида назад (слева) приводит к образованию транскрипционной паузы. Это состояние является обратимым, ЭК способен активироваться спонтанно или за счет реакции расщепления транскрипта, стимулируемой факторами СгеА и/илн СгеВ (слева внизу). Отщепление З'-коицевого фрагмента РНК-продукта приводит к образованию нового З'-конца РНК в каталитическом центре, и ЭК переходит в активное состояние. При обратном смещении более чем на три нуклеотида (справа), комплекс не может самостоятельно совместить каталитический центр с З'-концом РНК и инактивируется, что приводит к перманентной остановке транскрипции и образованию тупикового комплексаю В случае тупикового комплекса для совмещения каталитического центра с 3'-концом РНК потребуется отщепление РНК-олигонуклеотида длиной 3-20 нт. Такой тип расщепления способен стимулировать только фактор ОгеВ (справа внизу)
Смещение назад на 2-3 нт (происходит при транскрипционной паузе), как правило, является обратимым, и при длительной инкубации с субстратами комплекс способен возобновить элонгацию (Рис.1.2). Таким образом, при наличии субстратов, в ЭК с малым смещением осциллирующая РНКП стабилизируется в активном положении, при котором каталитический центр располагается в непосредственной близости от 3'-конца РНК [29, 33].
После смещения в обратном направлении более чем на 3 нт происходит перманентная остановка транскрипции. Фермент теряет способность самостоятельно совместить каталитический центр с 3'-концом транскрипта, который попадает во вторичный канал [34, 35]. Такой ЭК инактивируется, превращаясь в тупиковый комплекс, который неспособен удлинять РНК-транскрипт даже при длительной икубации с NTP (Рис. 2). Этот переход коррелирует со значительным смещением футпринта РНКП в обратном направлении. Так же как и ЭК, тупиковый комплекс обладает большой стабильностью [29, 33]. Выйти из состояния перманентной остановки РНКП может за счет активации эндонуклеазной реакции, в результате которой в каталитическом центре происходит гидролитический разрыв цепи РНК. После реакции расщепления вновь образованный 3'-конец РНК оказывается совмещённым с каталитическим центром, а отщепленный РНК-фрагмент покидает ЭК через вторичный канал [29, 33, 37]. Помимо эндонуклеазного расщепления транскрипта, реактивация тупиковых комплексов in vivo может происходить с помощью транскрипционного фактора Mfd. Этот фактор связывается с ДНК позади РНКП и транслоцирует ЭК вперёд по ДНК-матрице за счет энергии гидролиза АТР, таким образом совмещая 3'-конец
РНК с каталитическим центром и восстанавливая активность РНКП [37]. Аналогичным образом обратно-смещенный комплекс может быть активирован второй молекулой РНКП, активно транскрибирующей ДНК позади него [30].
Образование тупиковых комплексов возможно также в ходе инициации на некоторых промоторах. В таких инициаторных комплексах фермент не способен разорвать связи с промоторной ДНК и поэтому удерживается от транслокации вперед. С другой стороны, первичный транскрипт стабильно связан с комплексом и не может диссоциировать (абортироваться), чтобы позволить РНКП начать новый цикл транскрипции [38, 39]. Как и в случае перманентной остановки ЭК, РНКП в тупиковом инициаторном комплексе приобретает конформацию обратного смещения, при которой фермент смещается назад, а 3'-конец РНК попадает во вторичный канал. Такой комплекс не только не способен продолжить транскрипцию, но и блокирует инициацию на данном промоторе другими молекулами фермента, тем самым исключая возможность активации тупикового комплекса за счет кооперативного действия РНКП, двигающихся сзади. Аналогично ЭК, тупиковый инициаторный комплекс может быть активирован за счет реакции расщепления транскрипта [38, 39].