Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции

Диссертация

Автор: Воробьева, Надежда Евгеньевна

Заглавие: Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции

Справка об оригинале: Воробьева, Надежда Евгеньевна. Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Воробьева Надежда Евгеньевна; [Место защиты: Ин-т биологии гена РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 99 с. ил. Москва, 2009 99 c. :

Физическое описание: 99 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I Классификации корегуляторов транскрипции
II Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны
1 Семейство корегуляторных комплексов SAGA
2 MYST семейство
III АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие комплексы
1 SWI2/SNF2 семейство
2 Семейство ремоделирующих комплексов ISWI
3 Семейство комплексов CHD
IV Медиаторный комплекс
V Ядерные рецепторы
VI Динамика обмена коактиваторных комплексов на промоторе 40 ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 46 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I Материалы
II Методы
РЕЗУЛЬТАТЫ
I Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать транскрипцию в системе S2 клеток D Melanogaster
II Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена
III Колокализация компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции на репортерном гене, активируемом SAY доменом в ядре клетки
IV Экспрессированный в S2 клетках SAY домен способен образовывать белковый комплекс, характерный для полноразмерного SAYP
V Определение белка-партнера в составе коактиватора Brahma, взаимодействующего с SAY доменом
VI Определение белка-партнера в составе общего фактора транскрипции TFIID, взаимодействующего с SAY
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ

Введение:
Физиологическое состояние клетки определяется внешними сигналами и в большинстве случаев конечной точкой действия этих сигналов является изменение уровня транскрипции гена. Изучение сложных механизмов, позволяющих клетке распознавать и реагировать на внешние факторы, является одной из основных задач современной молекулярной биологии.
Первым этапом экспрессии большинства генов высших эукариот является транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой И. Этот процесс контролируется многоуровневым аппаратом, состоящим из нескольких тысяч транскрипционных факторов. Для инициации транскрипции какого-либо гена требуется воздействие различных коактиваторных комплексов, которые привлекаются ген-специфическими активаторами (Rosenfeld, Lunyak et al. 2006).
В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (GTFs-General Transcriptional Factors). Назначение первых - контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Основной задачей корегуляторных комплесов (коактиваторов и корепрессоров) является осуществление взаимной связи между активаторами и общими факторами транскрипции, а также изменение состояние хроматина в районе гена.
За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к коактиваторам транскрипции. Однако все их можно разделить на два больших класса: адаптеры и хроматин-модифицирующие и ремоделирующие комплексы (Lemon and Tjian 2000). В свою очередь коактиваторы, изменяющие состояние хроматина делятся на ковалентно модифицирующие гистоны и хроматин ремоделирующие.
Подобная классификация является достаточно условной. Так, TAFs (ТВР-ассоциированные факторы) рассматриваются и как GTFs, и как корегуляторы. Фактор SPBP является специфическим регулятором гена стромелизина-1 и одновременно -корегулятором, усиливающим действие ряда других специфических активаторов (Rekdal, Sjottem et al. 2000). В то же время известны специфические факторы транскрипции, осуществляющие взаимодействие с GTFs без участия корегуляторов. Так, активатор VP16C непосредственно взаимодействует с ТВР, TAF9, TFIIA и TFIIB (Nedialkov and Triezenberg 2004)
В настоящее время известно около 100 белков, составляющих основу транскрипционного аппарата (Pol II, GTFs, основные коактиваторы). В то же время количество известных специфических активаторов и репрессоров составляет несколько тысяч (Kadonaga 2004). Однако механизмы, по которым функционируют корегуляторы транскрипции, все еще остаются недостаточно изученными и представляют несомненный интерес.
В данной работе были изучены свойства основного консервативного домена коактиватора транскрипции SAYP: показано, что именно он отвечает за способность этого белка активировать транскрипцию, а также обнаружены взаимодействующие с ним белковые комплексы, которые и осуществляют механизм активации, регулируемый SAYP. Таким образом, показан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции посредством объединения двух больших транскрипционных комплексов в единый.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AD (activation domain) — Активационный домен
СВР (CREB binding protein) — Белок, связывающийся с CREB
ChIP (chromatin immunoprecipitation) Иммунопреципитация роматина
CTD (C-terminal domain) — С-концевой домен Pol II
DBD (DNA-binding domain) — ДНК-связываюгций домен e(y)3 (enhancer of yellow 3) — Энхансер тепа yellow 3
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) Иммуноферментный анализ
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Восстановление флуоресценции поле фотообесцвечивания
GTF (general transcription factor) — Общий фактор транскрипции
HAT (hi stone-acety ltransferase) — Гистонацетилтрансфераза
HDAC (hi stone-deacety lase) — Гистондеацетилаза
HMT (histone-methyltransferase) — Гистонметилтрансф ераза
IP (immunoprecipitation) — Иммунопреципитация
LBD (ligand-binding domain) — Лиганд-связываюпшй домен
NR (nuclear receptor) — Ядерный рецептор
PHD (plant homeodomain) — Гомеодомен растений
PIC (preinitiaitory complex) — Преинициаторный комплекс
Pol II (RNA polymerase II) — РНК-полимераза II
RING (Really Interesting New Gene) Белковый домен типа цинковых пальцев Cys3HisCys4
SAYP (supporter of activation of yellow protein) Белок, поддерживающий активацию yellow
TAF (TBP-associated factor) — Фактор, ассоциированный с TBP
TBP (TATA-binding protein) — ТАТА-связывающий белок
TFIIA.H (transcription factor for Pol II) — Транскрипционный фактор Pol II
UAS (upstream activator sequence) Вышележащая активирующая последовательность a.o. — Аминокислотный остаток п.н. — Пары нуклеотидов т.п.н. — Тысяча пар нуклеотидов
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Классификации корегуляторов транскрипции
За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к выполняющим коактиваторную/корепрессорную функцию в процессе регуляции транскрипции.
Эти комплексы обладают большим количеством разнообразных энзиматических активностей, по которым их можно разделить на два класса:
• первый класс состоит из комплексов, способных ковалентно модифицировать N-концевые остатки пистонов, то есть обладающих ацетилирующей/деацетилирующей активностью (HATs и HDACs), метилирующей/деметилирующей активностью (например, НМТ и LSD1), протеинкиназной, протеинфосфатазной, полиАДФрибозилазной, а также убиквитин и SUMO-лигазной активностями;
• второй класс включает в себя члены большого семейства АТФ-зависимых комплексов ремоделинга хроматина (например, SWI/SNF ремоделирующий комплекс), которые обладают АТФ-зависимой активностью и расплетают хроматинизированную ДНК, участвуя в скольжении нуклеосом. (Peterson 2002).
Также в отдельный класс адаптеров можно выделить коактиваторы-члены семейства TRAP/DRIP/Mediator/ARC комплекса. Это белки связываются непосредственно с транскрипционным фактором, рекрутируют РНК полимеразу II и взаимодействуют с общими факторами транскрипции.
Кроме приведенной выше классификации имеется также общая классификация корегуляторов транскрипции, основанная на наличии у корегулятора энзиматической активности. По этой классификации корегуляторы делятся на первичные и вторичные:
• первичные связываются непосредственно с фактором транскрипции и обладают собственной характерной энзиматической активностью,
• вторичные же после взаимодействия с транскрипционным фактором служат матрицей для привлечения других белков, обладающих специфическими энзиматическими активностями.
Отдельные белки-коактиваторы, такие как СВР, сами обладают гистонацетилтрансферазной активностью, а также способны рекрутировать другие HAT, такие как SRC-1 и pCAF. В тоже время СВР может выступать и как вспомогательный белок для вторичного коактиватора, такого как PGC-1 а, который связывается с транскрипционным фактором, но для энзиматической модификации хроматина он привлекает другие белки, такие как СВР, SRC-1 и другие факторы (Рис.1).
Рис.1 Многофункциональная природа коактиваторных белков (Spiegelman and Heinrich 2004). TF-1, TF-2 - транскрипционные факторы, СВР, PGC-lct — белки -коактиваторы для транскрипционных факторов I и 2 соответственно.
Ранее предполагалось, что регуляция активности гена на транскрипционном уровне осуществляется в основном за счет изменения количества или уровня активности транскрипционных факторов. В зависимости от внешних условий активаторные белки могут быть сами по себе транскрипционно индуцированы или репрессированы, а также активированы или дезактивированы посредством протеолиза, ковалентных модификаций или связывания с лигандом. Контроль ядерного NFkB в сигнальном пути реакции на воспаление, а также индукция миогенных b-HLH белков, таких как MyoD, во время мышечной дифференцировки являются классическими примерами подобного биологического контроля за счет изменения количества транскрипционных факторов. (Filvaroff and Derynck 1996; Lentsch and Ward 1999)
Однако недавние данные показали, что важный физиологический контроль системы регуляции генов осуществляется не только активаторами и репрессорами. Корегуляторные белки могут участвовать в регуляции гена не только как необходимое «колесо» в транскрипционной «машине», но также и являться первичными целями физиологических сигналов или сигналов при развитии организма. Самый простой сценарий регулирования экспрессии при помощи коактиваторов, это когда профиль экспрессии коактиватора имеет тканевую специфичность или присущ какой-то стадии развития, в то время, как транскрипционный фактор экспрессируется гораздо более широко. Примером такого механизма является действие коактиватора миокардина, который обеспечивает специфическую активацию генов клеток гладких мышц с участием SRF фактора. В этом процессе тканеспецифическим профилем экспрессии обладает именно коактиватор. В то время как сам SRF транскрипционный фактор не только не обладает специфичностью экспрессироваться в клетках гладких мышц, но даже не обладает тканевой специфичностью к мышцам. По похожему механизму функционируют белки коактиваторы ОСА-B и FOG, обеспечивая специфичность экспрессии на определенной стадии развития для более широко распространенных транскрипционных факторов Oct и GATA соответственно. (Spiegelman and Heinrich 2004)
П. Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны
Кроме участия в упаковке ДНК в ядре, нуклеосомные а также более высокого порядка хроматиновые структуры участвуют в регуляции процесса транскрипции в клетке, так как представляют собой барьер для транскрипционной «машины». Эксперименты с удалением гистонов в дрожжах подтверждают общую репрессирующую функцию для гистонов, а также показывают, что действие многих активаторов направлено на преодоление репрессирующих свойств гистонов, в том числе и путем удаления гистонов из активно транскрибируемого участка ДНК. (Han and Grunstein 1988)
За последнее десятилетие было проведено множество исследований, которые показали, что большое количество разнообразных модификаций (ацетилирование, метилирование, • фосфорилирование и убиквитинилирование) N-концевых «хвостов» гистонов не только коррелирует, но, по-видимому, и является причиной специфической активации и репрессии генов. (Berger 2002). Причем было показано, что N-концевые хвосты гистонов НЗ и Н4 зачастую принимают участие в механизме активации транскрипции, в отличие от N концов гистонов Н2А и Н2В. (An, Palhan et al. 2002)
Существует две модели, которые объясняют, как модификации с изменением зарядов хвостовых остатков могут влиять на взаимодействия гистонов с ДНК или белком, тем самым, изменяя структуру хроматина. Например, ацетилирование нейтрализует положительный заряд на лизине, тем самым уменьшая силу взаимодействия нуклеосомы с отрицательно заряженными фосфатными остатками ДНК, делая ДНК более доступной для таких активных процессов как транскрипция. (Wade, Pruss et al. 1997) Альтернативная, более сложная модель, учитывающая недавно открытые функции и партнеров для связывания многочисленных модификаций гистонов известна как «гистоновый код». В этой модели гистоновые модификации, действующие как специфические сайты (поодиночке и координировано, или последовательно на одном или многих гистонах), способны формировать «гистоновый код», распознаваемый транскрипционными факторами и корегуляторами и определяющий специфическое функционирование хроматина. (Turner 2000)
К настоящему времени описано множество кофакторов, которые вызывают вышеперечисленные модификации гистонов и которые связывают с различными механизмами активации и репрессии транскрипции. К сожалению, большинство исследований показывает только корреляцию между модификацией гистонов и регуляцией генов, но не доказывает, что они являются ее причиной.
Кроме того, у многоклеточных, имеются случаи, когда сами факторы регуляции транскрипции также являются субстратами для действия кофакторов, модифицирующих гистоны, примером такого действия является р53 (Gu and Roeder 1997).
Несмотря на то, что в достаточно короткое время накопилось множество информации о разнообразных модификациях гистонов, до сих пор еще не совсем ясно какие отношения возникают между механизмом регуляции транскрипции и различными модификациями. Однако уже ясно, что эти отношения цикличны и взаимозависимы. Например, корегуляторы, модифицирующие гистоны не способны достигнуть своих субстратов, пока они не «помечены» соответствующей модификацией.
Правильно организованный порядок привлечения коактиваторов диктуется комбинацией промотор-специфичных транскрипционных факторов. В этом контексте белковые домены этих факторов, такие как бромодомены, хромодомены, RING домены, PHD домены, F-боксы и SANT домены, а также узнающие последовательности для SUMO лигаз, протеинкиназ, и протеинфосфатаз способны распознавать специфические модификации и играть важную роль в процессе позиционирования корегуляторов на хроматине. Каждый из этих белковых доменов способен обладать двумя функциями: служить для узнавания специфической модификации гистонов, а также для осуществления этой модификации. Кроме того, известно, что хроматин-связывающие домены могут играть центральную роль в установлении периодичности транскрипционных состояний или достижении длительного транскрипционного состояния, когда это необходимо. Зачастую корегуляторы несут несколько таких узнающих/модифицирующих доменов. Например, не смотря на то, что СВР имеет бромодомен, для выполнения своей функции гистонацетилтрансферазы ему также необходим и PHD домен. В тоже время, Tip60 и MOF имеют хромодомены, но не обладают PHD или бромодоменами. Присутствие различных доменов в ацетилтрансферазах согласуется с взглядом на специфическое, своевременное вовлечение их в цикл активации. При репрессии наблюдаются сходные механизмы. Например, хромодомен белка НР1 узнает метилированный К9 гистона НЗ и запускается механизм длительного транскрипционного молчания гена (Volpe, Kidner et al. 2002). Кроме того, недавние исследования продемонстрировали, как некоторые хроматин-связывающие факторы могут изменять субстратную специфичность хроматин-модифицируюгцих ферментов. Примером служит привлечение LSD1 на промотор с помощью COREST, где диметил К4 гистона НЗ является субстратом для действия деметилазы (Lee, Wynder et al. 2005). В другом случае, когда LSD1 привлекается при помощи андрогенового рецептора, она функционирует как К9-НЗ деметилаза, а ее действие стимулирует лиганд-зависимую транскрипцию (Metzger, Wissmann et al. 2005).
Существование специфического порядка действия гистон/фактор-модифицирующих комплексов представляет собой сигнальный путь, определяющий активное/репрессированное состояние гена, а для сенсоров, действие которых специфично во времени, существуют дополнительные сигнальные пути, изменяемые через периодические интервалы обмена корегуляторными комплексами. Эта циклическая система зависит от системы упреждения, в которой какая либо метка, вызывающая преимущественное рекрутирование какого-то одного комплекса, может быть изменена, чтобы разрешить последующее привлечение следующих комплексов каскада, вызывая изменение в промоторном комплексе и гистоновых модификациях, которые стимулируют следующую когорту корегуляторов. Этот обмен также требует специальной стратегии для быстрого очищения промотора от предыдущего в цикле кофакторного комплекса, которая достигается или его быстрой деградацией и/или быстрым перемещением. Результатом такого циклического обмена является то, что постоянно изменяемый набор гистоновых модификаций и коакгиваторных комплексов является платформой для привлечения следующего кофакторного комплекса, основываясь на действии каждого предыдущего.