Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / ВЕТЕРИНАРНЫЕ НАУКИ / Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа

Диссертация

Автор: Борзенко, Евгений Владимирович

Заглавие: Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа

Справка об оригинале: Борзенко, Евгений Владимирович. Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа : диссертация ... кандидата ветеринарных наук : 16.00.03 Москва, 2005 109 c. : 61 05-16/204

Физическое описание: 109 стр.

Выходные данные: Москва, 2005






Содержание:

Часть
I Обзор литературы Ретровирусные инфекции человека и их диагностика
ГЛАВА 1 Общие сведения о молекулярной биологии ретровирусов
1 Геномная организация ретровирусов на примере ВИЧ-
2 Организация вириона
3 Жизненный цикл ВИЧ-
31 Проникновение в клетку
32 Репликация Синтез вирусной ДНК Интеграция провируса Регуляция транскрипции
4 Морфогенез и рилизинг
5 Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ
Глава 2 Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции
1 Методы твердофазного иммуноферментного анализа в диагностике инфекции ВИЧ
2 Тесты второго уровня (подтверждающие) в диагностике ВИЧинфекции
21 Иммуноб л отинг
22 Микровариант ИФА (В0Т-ЕЫ8А)
23 Радиоиммунопреципитация в диагностике инфекции ВИЧ
24 Метод непрямой иммзтюфлуоресцентной микроскопии
Глава 3 Диагностика и мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне
31 Диагностические и количественные варианты ПЦР и ее аналогов
32 Диагностика ВИЧ-инфекции на генетическом уровне: методы детекции ДНК и РНК
33 Подготовка пробы для анализа и использование внутреннего контроля при детекции ВИЧ-генома '
34 Гибридизационная детекция размноженного фрагмента на твердой фазе
35 Метод анализа с помощью разветвленных ДНК (BRANCHED D N A SIGNAL AMPLIFICATION ASSAY)
36 Мониторинг инфекции на генетическом уровне, определение типа циркулирующего ВИЧ
37 Анализ развития инфекции по данным количественных определений генетического материала
Глава 4 Диагностика инфекции ВИЧ-2 Часть П МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигена ВИЧ и антител к нему
11 Получение фракции анти—ВИЧ гамма—глобулинов
12 Определение белка в препаратах антител
13 Получение иммуноферментных конъюгатов
14 Получение вирусного антигена
141 Культуры вирус-продуцирующих клеток
142 Получение ВИЧ-1 АГ для постановки ИФА
143 Получение лизатов клеток, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-
144 Получение высокоочищенного антигена ВИЧ-
15 Иммобилизация антител к ВИЧ-1 на планшетах для проведения ИФА
16 Приготовление контрольных образцов положительной (К + ) и отрицательной (К -) сывороток
17 Приготовление субстрата для реакции ИФА
18 Проведение реакции конкурентного ИФА
181 Детекция антигенов ВИЧ-
182 Детекция антител к ВИЧ-
2 Разработка метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальнь»! белкам ВИЧ-
21 Получение иммуносорбента (ИС) с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ-1 для реакции ИБ
22 Получение ИС с иммоби^ризованными белками ВИЧ—1 для реакции ДИБ
23 Получение ИС с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ—2 и проведение реакции ИБ
24 Рекомбинантные белки ВИЧ-
241 gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в рекомбинантном штамме вируса осповакцины (рекВОВ)
242 gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в рек-ВОВ VC
243 gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в ЕСоИ, содержащей рекомбинантную плазмиду pRCp
244 env-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в EColi
245 gag и env-спеиифические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в ЕСоИ
25 Проведение иммуноферментной части ИБ и ДИБ
3 Проведение реакции непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии (НИФ)
4 Разработка радиоиммунопреципитационного анализа для определения антител к ВИЧ (РИПА)
41 Получение '^^1-меченого АГ ВИЧ-1 и ВИЧ-2 для проведения реакции радиоиммунопреципитации
42 Получение АГ ВИЧ, меченого ^^S-метионином
43 Проведение реакции радиоиммунопреципитации
44 Сыворотки для определения чувствительности и специфичности разработанного метода радиоиммунопреципитации
5 Сыворотки для определения специфичности и чувствительности тест-систем
6 Коммерческие тест-системы для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-
7 Твердофазный и конкурентный ИФА на основе синтетических пептидов
71 Синтетические пептиды
72 Проведение твердофазного и конкурентного ИФА на основе синтетических пептидов
73 Обработка спектров иммунореактивности (СПИР)
74 Определение УЗ-серотипа :
75 Синтетические пептиды, применявшиеся для идентификации иммунореактивных эпитопов в белках Т-лимфотропного вируса человека типа (HYLV-1)
8 Детекция и анализ вирус-специфических ДНК при ВИЧ-инфекции
81 Получение препаратов ДНК
82 Праймеры и зонды
83 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) Часть
III Собственные исследования
Глава 1 Разработка методов определения антигенов ВИЧ-1 и антител к нему и оценка их репрезентативности
11 Разработка конкурентного иммуноферментного анализа и оценка его репрезентативности
12 Иммуноферментная система для обнаружения антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-
13 Разработка метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-
14 Изучение возможности использования рекомбинантных белков для диагностики инфекции ВИЧ-
141 Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов ВИЧ1, экспрессируемых в рекомбинантном штамме вируса осповакцины (рек ВОВ) методом КИФА и ИБ
142 Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов ВИЧ1, экспрессируемых в рекВОВ методом иммуноблотинга
143 Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов, экспрессируемых в EColi, содержащей рекомбинантную плазмиду pRCp24, методом DOT-иммуноблотинга
144 Изучение иммунологических свойств env-специфических антигенов ВИЧ1, экспрессируемых в ЕСоИ методом КИФА
145 Изучение иммунологических свойств рекомбинантных белков gag и env ВИЧ-1, экспрессируемых в Е Coli методом иммуноблотинга
15 Разработка модифицированного метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-
16 Разработка метода радиоиммунопреципитации для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и оценка его репрезентативности
161 Сравнение методов радиоиммунопреципитации и иммуноблотинга в серодиагностике инфекции ВИЧ
162 Использование метода радиоиммунопреципитации в сероэпидемиологических обследованиях групп риска для тестирования сывороток, имеющих сомнительные результаты иммуноблотинга
163 Определение антител к ВИЧ-2 методом радиоиммунопреципитации
17 Идентификация иммунореактивности эпитопов в белках, кодируемых генами gag, env и pol Т-лимфотропного вируса человека типа (HTLV-I) с использованием синтетических пептидов
18 Изучение иммунореактивности ВИЧ-позитивных сывороток методом ИФА на основе синтетических пептидов
181 Иммунореактивность ВИЧ-позитивных сывороток к V3-имитирующим пептидам в процессе развития инфекции
182 Динамика уровня иммунореактивности ВИЧ-позитивных сывороток к V3имитирующим пептидам в процессе развития инфекции
19 Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии
Глава 2 Детекция и анализ вирус-специфических ДНК и РНК при ВИЧинфекции
21 Детекция провируса в ДНК лимфоцитов Мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне
22 Препараты ДНК, праймеры и зонды
23 Детекция провируса ВИЧ с анализом гибрида гель-электрофорезом
24 Гибридизация со связыванием на ГАП
25 Комбинация ПЦР-транскрипция
26 Анализы проб из крови пациентов
27 Разработка метода количественной оценки вирус-специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции
28 Конструирование внутренних стандартов для количественной ДНК, РНКПЦР и изучение их свойств в модельной системе
Глава 3 Альтернативные лабораторные методы детекции ВИЧ
31 Разработка метода диагностики ВИЧ-инфекций, основанного на принципах лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА), с использованием импортной аппаратуры и реактивов Разработка отечественного аппаратурного и реактивного обеспечения для конструирования тест-систем на основе ЛИФА
311 Разработка методов диагностики ВИЧ-инфекций с помощью ЛИФА Определение уровня антител к ВИЧ в сыворотках крови людей с помощью белка А, меченного ионами европия
312 Разработка конкурентной тест-системы ЛИФА для выявления антител к белку р24 в сыворотках крови человека
313 Разработка отечественного и реактивного обеспечения для конструирования ЛИФА-систем
32 Разработка экспресс метода диагностики ВИЧ-инфекции с помощью мишень-чувствительных липосом
33 Метод ЭПР для детекции ВИЧ
34 Методы электронной микроскопии для детекции ВИЧ
Выводы

Введение:
Актуальность проблемы. Два последних десятилетия прошлого века (XX) привели к открытию пяти экзогенных ретровирусов человека, играющих важную роль в патологии. Это HTLV-1 и H T L V 2 - этиологические агенты Т-клеточных лейкозов и параличей, ВИЧ1 и ВИЧ-2 - вызывающие ВИЧ/СПИД [40, 61] и 5-ый ретровирус человека (HRV5), этиологически связанный с тяжелыми артритами и системной красной волчанкой [204].Особый размах приобрела эпидемия ВИЧ/СПИД, принявшая характер пандемии - всемирной эпидемии. От нее пострадало более 60 миллионов человек и более 20 миллионов человек умерло. Уже в 80-е гг. после обнаружения вируса иммунодефицита человека [40, 83, 131] и разработки первых тест-систем для выявления антител к ВИЧ 477] стало ясно, что СПИД является лишь заключительной фазой ВИЧ-инфекции и количество ВИЧ-инфицированных существенно превышает число больных СПИДом. Поэтому для достоверного описания эпидемии наряду с эпидемиологическими подходами абсолютно необходимы методы лабораторной диагностики.В 1985 году была поставлена задача выяснить вопрос о наличии ВИЧ/СПИД в нашей стране, чтобы определить размеры возможной опасности. К моменту начала наших исследований этот вопрос был совершенно не изучен. Выявление первых случаев ВИЧ-инфекции привело к необходимости создания методов лабораторной диагностики как важнейшего звена системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией. Проблема осложнялась тем, что в отечественном здравоохранении методы иммуноферментного анализа (ИФА), на основе которого были разработаны первые диагностические тесты для определения антител к ВИЧ, не использовались.Поэтому уже на первом этапе предстояло решить несколько взаимосвязанных задач по разработке и внедрению иммуноферментного анализа, методов подтверждающей лабораторной диагностики и экспертизных тестов, чтобы грамотно мониторировать надвигающуюся эпидемию ВИЧ/СПИД. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке комплекса методов лабораторной диагностики ВРГЧ-инфекции, включающего первичную диагностику, подтверждающую диагностику и экспертизную диагностику. Данная работа предусматривала внедрение в практическое здравоохранение методов иммуноферментного анализа и подтверждающей лабораторной диагностики. Кроме того, необходимо было разработать высокоточные методики для детекции ретровирусов человека с целью применения их в фундаментальных исследованиях.В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. разработать иммуноферментный анализ для определения антигенов ВИЧ и антител к нему, изучить репрезентативность созданной тест-системы и внедрить в практическое здравоохранение; 2. разработать модифицированный метод иммуноферментного анализа для обнаружения анти-ВИЧ-1 антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-1; 3. разработать методы иммуноблотинга (ИБ) для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2; 4. изучить иммунологические свойства ряда генно-инженерных антигенов ВИЧ-1 и перспективность их применения для создания диагностических тест-систем по определению антител к ВИЧ; 5. разработать экспертизный метод радиоиммунопреципитации (РИПА) с использованием ^^ 1^ и - меченого высокоочищенного антигена для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВРТЧ-2. Определить чувствительность и специфичность разработанного метода на панели референс-сывороток и в ходе серо-эпидемиологических исследований; 6. разработать методы диагностики ВИЧ-инфекций, основанные на принципах лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА); 7. разработать методы эпитопного картирования ВИЧ-1 и НТЬУ-1 с помопдью синтетических пептидов, имитирующих функционально важные районы ретровирусов человека; 8. разработать метод количественного определения вирусспецифических ДНК и РНК. Оценить применимость данного метода в модельных клеточных системах репродукции ВИЧ и на клиническом материале от ВР1Ч-инфицированных лиц.Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработана и внедрена в производство иммуноферментная тест-система для одновременного определения антигенов ВИЧ-1 и антител к ВИЧ-1.2. С помощью синтетических пептидов, имитирующих функционально важные районы ЕПУ белков ретровирусов, показана диагностическая и прогностическая важность УЗ района §р120 ВИЧ-1 и обнаружены новые эпитопы в НТЬУ1.3. Разработан комплекс методов для подтверждающей диагностики ВИЧ-1, включающий методы непрямой иммунофлуоресценции (НИФ), различные варианты ИБ и РИЛА. При изучении панели рефернс-сывороток и в ходе сероэпидемиологических исследований установлено, что с помощью этих методов удается повысить надежность выявления антител к ВР1Ч-1 по сравнению с имеющимися методиками.4. Предложены оригинальные методы количественной оценки содержания вирусспецифических РНК и Д1Ж ВИЧ-1.5. Показана принципиальная возможность экспрессдиагностики ВИЧ-инфекции с помощью ЛИФА и мишеньчувствительных липосом.Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработаны комплекс методов лабораторной диагностики ВИЧ/СПИД, а также методы лабораторной диагностики ВИЧ-2 и НТЬV-1.Впервые предложена иммуноферментная тест-система для одновременного определения антигенов ВИЧ-1 и антител к ВИЧ-1.Данная тест-система была внедрена в производство.Разработан лабораторный регламент иммуноферментной тестсистемы для обнаружения антител к ВИЧ-1 в составе иммунных комплексов с антигенами ВИЧ-1.С помощью синтетических пептидов, имитирующих функционально важные районы Епу белков ретровирусов, показана диагностическая и прогностическая важность УЗ района gpl20 ВИЧ1 и обнаружены новые эпитопы в НТЬУ-1.Разработан комплекс методов для подтверждающей диагностики ВИЧ-1, включающий методы непрямой иммунофлуоресценции (НИФ), различные варианты ИБ и РИПА. Показано, что ложноположительные и ложноотрицательные результаты тестирования сывороток в различных подтверждающих тестах имеют разную природу. Сделан вывод, что для надежного выявления маркеров ВИЧ-инфекции необходимо использование нескольких альтернативных подтверждающих тестов.Предложены оригинальные методы количественной оценки содержания вирусспецифических РНК и ДНК ВИЧ-1.Показана принципиальная возможность экспресс-диагностики ВИЧ-инфекции с помощью ЛИФА и мишень-чувствительных липосом.Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 239 страницах машинописного текста, включая 23 таблицы, 16 рисунков, и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы.Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы.Библиографический список включает 211 ссылок.Публикации и апробация работы. По материалам работы опубликовано 48 статей, 31 тезис, оформлено 5 патентов и авторских свидетельств.Полученные в ходе работы данные представлены на 30 международных и отечественных конференциях и симпозиумах.Отдельные разработки были отмечены Премией Ленинского Комсомола (1987г.) и Золотой медалью ВДНХ (1988г.).В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и апробационного Совета Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 21 февраля 2001 года.Автор благодарит всех своих соавторов и сотрудников, участвовавших в проведенных исследованиях.Часть I. Обзор литературы.Ретровирусные инфекции человека и их диагностика.Два последних десятилетия прошлого века (XX) привели к открытию пяти экзогенных ретровирусов человека, играющих важную роль в патологии. Это НТЬУ-1 и НТЬУ-2 - этиологические агенты Т-клеточных лейкозов и параличей, ВИЧ-1 и ВР1Ч-2 вызывающие ВИЧ/СПИД [40, 61] и 5-ый ретровирус человека (Е0?1У5), этиологически связанный с тяжелыми артритами и системной красной волчанкой [204].Успехи молекулярной биологии в исследовании геномной организации ретровирусов, клонирование и экспрессия отдельных частей генома, использование рекомбинантных белков и пептидов, имитирующих иммунодоминантные эпитопы ретровирусных белков, позволили разработать широкий набор диагностических методов, пригодных для детекции ретровирусов и антител к ним. Часть этих методов внедрена в практическое здравоохранение, другие методы используются для подтверждающей, экспертизной или экспрессдиагностики, а некоторые методы нашли применение в лабораторной практике и научных исследованиях. Но все же достижения стали возможны на основе глубокого изучения генетической организации генома ретровирусов и иммунохимического анализа антигенных детерминант ретровирусных белков.