Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биотехнология

Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

Диссертация

Автор: Гасанов, Евгений Валерьевич

Заглавие: Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

Справка об оригинале: Гасанов, Евгений Валерьевич. Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius : диссертация ... кандидата химических наук : 03.00.23 / Гасанов Евгений Валерьевич; [Место защиты: Моск. гос. акад. тонкой хим. технологии им. М.В. Ломоносова] - Москва, 2009 - Количество страниц: 83 с. ил. Москва, 2009 83 c. :

Физическое описание: 83 стр.

Выходные данные: Москва, 2009






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами
22 Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с субстратом
23 Аспартильные протеазы
24 Металлопротеазы
25 Цистеиновые протеазы
26 Сериновые протеазы
27 Заключение
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
31 Реактивы и материалы
32 Общие методы
33 Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках В subtilis
34 Получение нативного фермента (BIGEP-Bs) из клеток Bacillus subtilis
35 Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках Е coli
36 Очистка рекомбинантного пропептида BIGEP (HP)
37 Очистка рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2, N-3)
38 Ренатурация и активация рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2, N-3)
39 Электронная микроскопия
310 Получение пропептида BIGEP слитого с целлюлозосвязывающим доменом CelD целлюлазы Anaerocellum thermophilum (CBD-P)
311 Ренатурация зрелых частей BIGEP рекомбинантым пропептидом in trans
312 Обработка BIGEP аминопептидазами
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
41 Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника
42 Изучение созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius
421 Влияние природы (-1) остатка на созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius
422 Эффект делеции З'-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного белка клетками Bacillus subtilis
423 Созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius in vitro
424 Автоактивация глутамилэндопептидазы В intermedius
43 Изучение роли N-концевого остатка в функционировании зрелой глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius
431 Получение вариантов глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius без N-концевых остатков
432 Исследование созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с собственным пропентидом в системе in trans
433 Получение глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с тремя удаленными N-концевыми остатками
44 Заключение
5 ВЫВОДЫ
6 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 BIGEP глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius
2 CBD целлюлозосвязывающий домен CelD целлюлазы Anaerocellum thermophilum
3 PMSF фенилметилсульфонилфторид
4 Tris — трис-(гидроксиметил)аминометан
5 Z-Glu-pNA 1ч[-бензилоксикарбонил-Ь-глутамил-и-нитроанилид
6 ГЭПаза глутамилэндопептидаза
7 ПААГ полиакриламидный гель
8 ПЦР полимеразная цепная реакция

Введение:
Актуальность исследования В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки — ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, по-разному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии иротеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins (BIGEP) - сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.Цели и задачи исследования Основной целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глутаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи: 1) изучение механизма созревания предшественника BIGEP; 2) получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.Научная новизна исследования В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга BIGEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента.Практическая значимость исследования Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.