Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России

Диссертация

Автор: Бреннер, Евгений Владиславович

Заглавие: Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России

Справка об оригинале: Бреннер, Евгений Владиславович. Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Бреннер Евгений Владиславович; [Место защиты: Гос. науч. центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"] - Новосибирск, 2009 - Количество страниц: 129 с. ил. Новосибирск, 2009 129 c. :

Физическое описание: 129 стр.

Выходные данные: Новосибирск, 2009






Содержание:

1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Введение
211 Метаболизм феншаланина в норме
212 Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии
213 Материнская фенилкетонурия
214 Современная классификация форм фенилкетонурии
22 Распространенность фенилкетонурии
23 Структура фенилаланингидроксилазы
24 Структура гена ФАГ
25 Мутации гена ФАГ
26 Влияние мутаций гена фенилаланингидроксилазы на проявления фенилкетонурии
261 Моделирование влияния мутаций гена ФАГ на структуру фенилаланингидроксилазы
262 Экспрессия in vitro как метод исследования эффекта мутаций на активность ФАГ
263 Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ
27 Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии
271 Исследование полиморфизма сайтов рестрикции гена ФАГ
272 Исследование полиморфизма STR и VNTR повторов гена ФАГ
273 Исследование происхождения мутантных аллелей
28 Перспективные подходы к терапии фенилкетонурии
281 Диетотерапия
282 Генотерапия фенилкетонурии
283 Медикаментозная терапия фенилкетонурии
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
31 Материалы
32 Методы
321 Обследованная группа
322 Консервирование крови
323 Выделение геномной ДНК из крови по МйИег
324 Полимеразная цепная реакция
324а) ПЦРрайонов гена ФАГ
3246) РеПЦР STR и VNTR гена ФАГ
325 Электрофорез в агарозном геле
32 б Электрофорез в полиакриламидном геле
327 Очистка продуктов ПЦР
327а) Очистка продуктов ПЦР сорбцией на стекловолокне
3276) Гелъфгшътрация продуктов ПЦР на колонках Centrisep Spin Columns
327в) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-5058 327г) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G
328 Реакция Сэнгера
329 Очистка продуктов реакции Сэнгера
3210 Фрагментный анализ продуктов ПЦР на автоматических генных анализаторах
3210 а) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов
32106) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров
3210в) Спектральная калибровка генных анализаторов для выполнения фрагментного анализа
3210г) Определение поправки между реальными и наблюдаемыми при фрагментном анализе размерами
3211 Компьютерная обработка данных
3211а) Анализ электрофореграмм
32116) Анализ секвенограмм автоматических генных анализаторов
3211в) Анализ электрофореграмм при фрагментном анализе
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
41 Полиморфизм гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Западной Сибири Алтайского края и Саратовской области
411 Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае
412 Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области
42 Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H
43 Пренатальная диагностика фенилкетонурии в семьях больных фенилкетонурией
44 Универсальный метода идентификации однонуклеотидных замен
5 ВЫВОДЫ

Введение:
Фенилкетонурия (ФКУ) является одним из распространенных наследственных заболеваний человека. Большое клиническое и биохимическое разнообразие форм этой болезни обусловлено большим разнообразием обуславливающих его мутаций (известно более 500 мутаций гена ФАГ, приводящих к ФКУ). Помимо тяжести заболевания в каждом случае генотип больного ФКУ определяет эффективность традиционной диетотерапии и возможность использования альтернативных способов терапии ФКУ (например, фенилаланинаммиаклиазой).
Спектры мутаций и нейтральных полиморфизмов гена ФАГ значительно различаются в разных популяциях и географических регионах мира. Это, по всей видимости, является отражением особенностей формирования этих популяций и различного влияния факторов естественного отбора на больных ФКУ, имеющих разный жизненный уклад, традиции питания и т.п. Для того чтобы более точно определить происхождение и клинические последствия той или иной мутации, необходимо как можно более полно охарактеризовать носителей этой мутации в каждой популяции. Дополнение таких исследований идентификацией гаплотипов гена ФАГ позволяет делать выводы о генетической структуре популяции, выявлять потоки генов, её формирующих, а также оценивать степень вероятности возникновения той или иной мутации de novo.
Успешность всех подходов к лечению фенилкетонурии полностью определяется своевременностью её диагностики и возможностью получить сведения о типе мутаций, обуславливающих каждый конкретный случай заболевания. Чем раньше происходит диагностика болезни, тем лучше прогноз её терапии. Оптимальной является пренатальная диагностика фенилкетонурии, поскольку она делает возможной не только максимально эффективную терапию, но и принятие решения о целесообразности сохранения беременности.
В. то же время многообразие обуславливающих фенилкетонурию мутаций делает её своевременную диагностику трудновыполнимой и дорогостоящей, поскольку требует привлечения, методов1 массового типирования точковых мутаций, либо секвенирования гена фенил ал анингидроксил азы у каждого пациента. Таким образом, существует насущная- потребность, в недорогих, быстрых и достоверных методах идентификации обуславливающих фенилкетонурию мутаций, применимых в условиях клинических лабораторий, в. том числе для пренатальной диагностики.
Целью настоящей настоящей работы являлось исследование спектра мутаций, гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае, а также исследование ассоциации этих мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и- возможности возникновения- идентифицированных мутаций в исследованных регионах «
России de novo. В цели-настоящей-работы также входила разработка простых и достоверных методов1 идентификации обуславливающих ФКУ мутаций, в т.ч. пренатально.
Задачами работы,являлись:
Идентификация мутаций гена ФАГ у больных ФКУ и их родственников из указанных регионов России гипотезонезависимыми методами, позволяющими детектировать все, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.
• Разработка на основе фрагментного анализа продуктов ПЦР автоматизированного' массового метода' идентификации аллельных вариантов^ТЯ h VNTR повторов гена ФАГ.
• Исследование сцепления идентифицированных мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что при сравнении с аналогичными данными для других стран и регионов позволило судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций.
• Разработка простого и достоверного метода пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем контаминации плодного биоматериала.
• Разработка простого универсального метода детекции точечных мутаций на основе аллель-специфичной ПЦР.
Научная новизна работы:
Исследован спектр мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАГ) обуславливающих ФКУ в. Саратовской области, Алтайском крае и ряде j регионов Западной Сибири (Новосибирская, Кемеровская области). Впервые для регионов России идентификация обуславливающих ФКУ мутаций производилась гипотезонезависимым методом - определением нуклеотидных последовательностей районов гена ФАГ, позволило1 детектировать любые, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.
Впервые проведено систематическое исследование сцепления всего спектра мутаций гена' ФАГ в указанных регионах России с гаплотипами этого гена, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и возможности возникновения идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo.
Доказано независимое повторное возникновение обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H гена ФАГ, что было неизвестно ранее.
Впервые показана возможность использования конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР для обеспечения дискриминации аллельных вариантов по наблюдаемой задержке при гель-электрофорезе продуктов ПЦР.
Практическая значимость работы. Идентифицированы генотипы больных ФКУ по локусу ФАГ в 73 семьях Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края. Полученные результаты предоставлены врачам местных медико-генетических консультаций и перинатальных центров для контроля правильности выбранной стратегии терапии этих случаев ФКУ.
Разработаны методические рекомендации для выполнения фрагментного анализа на автоматических генных анализаторах с использованием реактивов отечественного производства, что сделало возможным внедрение этого метода на базе Центра коллективного пользования СО РАН «Секвенирование ДНК».
Разработан скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.
Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты с помощью секвенирования и фрагментного анализа.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3-я Международная конференция «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007 г.), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006 г.), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), International Conference "New information technology in medicine, biology, pharmacology and ecology" (Ялта-Гурзуф, 2003 г.),
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение
Фенилкетонурия (ФКУ, McKusick MIM  261600 ) является одним из распространённых и хорошо изученных наследственных заболеваний человека. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Впервые ФКУ была описана в 1934 году норвежским врачом и биохимиком Феллингом (Foiling, 1934а). Им было установлено, что ФКУ развивается в результате нарушения нормального метаболизма незаменимой аминокислоты фенилаланина и накопления в тканях организма токсичных продуктов альтернативных путей его деградации. Феллинг предложил и первый метод диагностики фенилкетонурии, основанный на качественной реакции патологических метаболитов фенилаланина в моче больного фенилкетонурией с хлоридом железа (III) (Foiling, 1934b). В настоящее время этот метод применяется в отношении всех новорождённых большинства стран в т.ч. и России. Хотя он и не даёт представления о тяжести заболевания в каждом конкретном случае и является, по существу, поздней диагностикой фенилкетонурии (т.к. её диагностика происходит уже после формирования ЦНС и начала активации патологического метаболизма фенилаланина), он прочно занял место среди обязательных анализов новорожденных, в т.ч. и потому, что предъявляет минимальные требования к необходимому оборудованию и квалификации персонала.
2.1.1. Метаболизм фенилаланина в норме
В норме in vivo ключевой стадией метаболизма фенилаланина является его гидроксилирование с образованием тирозина. Было показано, что для гидроксилирования фенилаланина необходимо, как минимум, два белковых фактора (Mitoma, 1956). В последствии эти факторы были охарактеризованы
Kaufman, 1958a, 1959, 1963) как ферменты фенилаланингидроксилаза (ФАГ) и дигидроптеридинредуктаза (ДГПР). Первый из них непосредственно катализирует реакцию гидроксилирования фенилаланина. Второй осуществляет восстановление дигидробиоптерина до тетрагидробиоптерина - кофактора фенилаланингидроксилазы, окисляемого в процессе гидроксилирования фенилаланина.
Дальнейшие исследования показали, что гидроксилирование фенилаланина достаточно сложный процесс, в котором участвуют ещё дополнительно не менее 4-х ферментов и их кофакторов. Схематически этот процесс приведён на рисунке 1.
GTP-CH н I сн,—с—соон * I
L-фенилаланин
НО' н I сн2—с—соон I nh2 L-тирозин
4а-карбиноламин
4а-карбиноламин дегидратаза н2о А
NADH+H+ IIzN [j qBH2
Рис. 1. Гидроксилирование фенилаланина, включая синтез и регенерацию птеридинового кофактора. Обозначения: GTP- гуанозин-трифосфат, GTP-CH- GTP-циклогидролаза, DHNP- d -эритро-дигидронеоптерин трифосфат, 6-PTS- 6-пирувоил тетрагидробиоптерин, 6-РТ—пирувоил тетрагидробиоптерин, qBH2 хиноидный дигидробиоптерин, ВН4Х-эритро-тетрагидробиоптерин
Фенилаланингидроксилаза . катализирует гидроксилирование фенилаланина до тирозина и сопутствующее этому окисление кофактора тетрагидробиоптерина (ВЩ) до 4а-карбиноламина. Регенерация ВЩ осуществляется в1 две стадии 4а-карбиноламин дегидратазой и дигидроптеридинредуктазой. Синтез ВЩ de novo осуществляется из гуанозинтрифосфата в несколько стадий с участием GTP - циклогидролазы, 6-пирувоилтетрагидробиоптеринсинтазы (6-PTS) и сепиаптеринредуктазы.
Следует отметить, что ВН4 является кофактором не только ФАГ, но и тирозингидроклилазы - ключевым: . ферментом метаболизма катехоламиновых нейромедиаторов, а также триптофангидроксилазы — ферментом, участвующем1 в метаболизме сератониновых медиаторов: Таким образом, суммарный уровень биосинтеза и регенерации ВН4 должен соответствовать суммарной потребности этих ферментов в кофакторе.
Первоначально в экспериментах с клетками печени эмбрионов крысы было показано, что гидроксилирование фенилаланина преимущественно происходит в печени (Crawfurd et al, 1981). Однако в более поздних работах демонстрируется важная роль почек в этом процессе. Было также высказано предположение; что; почки являются основным источником тирозина (Moller et al, 2000). .