Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Молекулярная биология

Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования

Диссертация

Автор: Гарафутдинов, Равиль Ринатович

Заглавие: Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования

Справка об оригинале: Гарафутдинов, Равиль Ринатович. Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 Б.м., б.г. 144 c. : 61 06-3/1131

Физическое описание: 144 стр.

Выходные данные: Б.м., б.г.






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 ДНК-идентификация личности
111 Идентификация личности
112 ДНК-идентификация личности на основе вариабельного числа тандемных повторов VNTR-локусов
113 ДНК-идентификация личности на основе коротких тандемных повторов STR-локусов
114 ДНК-идентификация личности на основе однонуклеотидного полиморфизма ДНК
12 Методы обнаружения однонуклеотидных замен
121 Однонуклеотидное удлинение праймера
122 Аллель-специфичная ПЦР
123 Анализ снипов путем определения температур плавления дуплексов
124 Инвазивное расщепление
125 Методы анализа снипов, основанные на лигировании
126 Аллель-специфичная гибридизация
127 Анализ однонуклеотидных замен с помощью ДНК-чипов
128 Изготовление ДНК-чипов
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
21 Краткая характеристика объектов исследований
22 Выделение геномной ДНК человека
23 Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов
24 Фосфорилирование олигонуклеотидов
25 Полимеразная цепная реакция - ПЦР
26 Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР
27 Лигазная цепная реакция в реальном времени - ЛЦР-РВ
28 Аналитический гель-электрофорез ДНК
29 Технология циклирующей пробы - ТИП
210 Иммобилизация олигонуклеотидов на стекло
211 Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы
212 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
213 Реактивы и материалы
214 Составы использованных стандартных растворов
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Принципы генетического штрих-кодирования
32 Методы детекции однонуклеотидных замен
321 Лигазная цепная реакция в режиме реального времени
322 Технология циклирующей пробы
323 ТЦП в чиповом варианте
324 Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы с рибобиконом
33 Базы данных по генетическим штрих-кодам населения и их программное сопровождение

Введение:
Актуальность темы. В настоящее время человечество стоит перед необходимостью однозначно идентифицировать любого человека по только ему свойственным биологическим признакам вследствие высокого уровня криминалитета, терроризма, происходящих природных и техногенных катастроф, приводящих зачастую к многочисленным, иногда неподдающимся опознанию жертвам. Начало ДНК-идентификации личности, которая насчитывает уже более двух десятилетий, было положено работами А. Джеффриса, впервые предложившего использовать высокополиморфные локусы для генетической паспортизации человека [Jeffreys et al., 1985; Gill et al., 1985]. На основе минисателлитного участка, присутствующего в первом интроне миоглобинового гена, ими были созданы гибридизационные пробы 33.15 и 33.6, получившие впоследствии название «пробы Джеффриса». Помимо них для ДНК-идентификации личности применялись и другие гипервариабельные гибридизационные пробы, в том числе основанные на тандемных повторах, локализованных в гене белка 3 фага М13 [Рысков и др., 1988; Иванов и др., 1989]. Однако сопоставление электрофоретических картин полиморфизма ДНК разных людей велось практически по принципу «похоже — не похоже», что сильно затрудняло их сравнение. Несмотря на определенные трудности в использовании проб, относящихся к VNTR-локусам (Variable Number of Tandem Repeats), они широко использовались в криминалистике на протяжении целого десятилетия и при этом сыграли значительную роль в установлении виновности подозреваемых.
В начале 90-х гг. прошлого столетия на смену проб к VNTR-локусам пришел анализ STR-локусов (Short Tandem Repeats), отличающихся от первых более короткими, как правило, 2-5 нуклеотидными повторяющимися мотивами [Edwards et al., 1991]. Поскольку нередки случаи обнаружения на месте преступления биологических следов в крайне малых количествах и подчас содержащих ДНК в деградированном состоянии, не позволяющем провести анализ VNTR-полиморфизма, то одним из главных преимуществ использования STR-локусов стало то, что для их анализа требовалось значительно меньшее количество ДНК. В последние годы наблюдается тенденция использования в ДНК-идентификации личности так называемых mini STR-локусов, характеризующихся сближенным расположением праймеров к непосредственно микросателлитным повторам, что способствует повышению точности анализов при работе с сильно фрагментированной ДНК [Butler et al., 2003; Coble, Butler, 2005].
Серьезным недостатком использования для ДНК-идентификации STR-локусов была и остается их сильная зависимость от расовых и национальных особенностей, из-за которой в одной только Великобритании существует 3 разных базы данных, где сведения о людях хранятся сообразно их расовым признакам. В одной из них содержатся сведения о европейцах, в другой - об азиатах, включая индусов, в третьей собраны данные о выходцах из стран Африки и Карибского бассейна. При этом базы данных не могут быть сравнены между собой. Следовательно, для определения принадлежности неизвестных ДНК-следов, оставленных на месте преступления, экспертам необходимо проводить несколько анализов, используя разные коммерческие наборы с соответствующими STR-локусами. Это свидетельствует в пользу необходимости замены используемых маркерных признаков на основе STR-локусов другими, в гораздо меньшей степени зависимыми от расовой и национальной принадлежности носителей ДНК.
В настоящее время на роль новых маркеров — маркеров третьего поколения, претендуют однонуклеотидные замены [Budowle et al., 2005; Divne, Allen, 2005; Dixon et al., 2005; Vallone et al., 2005]. Они теоретически могут обеспечить уникальность каждого индивидуума при ДНК-идентификации [Gill, 2001] и пригодны для создания на их основе истинно цифровых баз данных с возможностью поиска и сравнения по ним.
В сегодняшний день анализ снипов ведется разными методами, однако разработка новых более производительных методов продолжается. Серьезное внимание уделяется подходам, которые потенциально могут быть переведены в более производительный и дешевый биочиповый формат. Обилие методов анализа снипов свидетельствует о том, что не предложен метод, удовлетворяющий всем требованиям.
Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка принципов однозначной ДНК-идентификации личности и новых методов обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в режиме реального времени.
В задачи исследования входило:
1) сформулировать принципы выбора генетических маркеров, способных обеспечить индивидуальность каждого члена общества;
2) разработать принципы генетического штрих-кодирования на основе индивидуального полиморфизма ДНК человека;
3) создать прообраз банка данных по генетическим штрих-кодам людей и его программное сопровождение;
4) разработать новые методы обнаружения однонуклеотидных замен в режиме реального времени с возможностью их перевода в ДНК-чиповый формат.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые предложен способ генетического штрих-кодирования человека, основанный на индивидуальном полиморфизме однонуклеотидных замен, теоретически обеспечивающий однозначную ДНК-идентификацию личности. Впервые созданы прообразы банка данных по генетическим штрих-кодам людей, написаны компьютерные программы для ввода данных, их поиска и сравнительного анализа. Лигазная цепная реакция (ЛЦР) амплификации фрагментов ДНК преобразована для ее проведения в режиме реального времени. Предложены новые методы детекции однонуклеотидных замен, основанные на лигазной цепной реакции, на объединении технологии циклирующей пробы с молекулярным рибонуклеотидным сигнальным огнем (рибобиконохм), а также на объединении двух последних с изотермической амплификацией по типу «катящегося кольца». Для последнего подхода предложен более экономичный вариант за счет применения на стадии лигирования дополнительного короткого олигонуклеотида с дискриминирующими нуклеотидами на З'-конце, что позволяет более длинный олигонуклеотид сделать общим для детекции всех вариантов нуклеотидов в конкретном снипе. Показана принципиальная возможность перевода объединенной технологии поиска однонуклеотидных замен с помощью циклирующей пробы и рибобикона в более удобный для массовых анализов ДНК-чиповый формат.
Практическая значимость работы заключается в разработке генетического штрих-кода человека, который может стать дополнительной характеристикой каждого индивидуума, упорядочить учет граждан, помочь правоохранительным органам в борьбе с преступностью. Социальная значимость генетических штрих-кодов и баз данных по ним заключается в однозначной идентификации тел погибших без привлечения для анализа ДНК родственников. Предложенные варианты лигазной цепной реакции в реальном времени применимы также для целей общей высокочувствительной и специфичной ДНК-диагностики.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке" (Москва, 2004), на II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), на международном симпозиуме "Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), на VI Международном форуме "Высокие технологии XXI века" (Москва, 2005), на 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), на республиканской научно-практической конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа, 2006). Конкурсная поддержка работы. Исследования были выполнены в соответствии с Федеральной целевой программой «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», с Научной программой Министерства науки и высшего образования РФ «Развитие научного потенциала высшей школы», в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ-НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№ 02.438.11.7003 и 02.445.11.7018. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах, содержит 29 рисунков и 4 таблицы.