Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биотехнология

Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR

Диссертация

Автор: Немцова, Елена Валентиновна

Заглавие: Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR

Справка об оригинале: Немцова, Елена Валентиновна. Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.23 / Немцова Елена Валентиновна; [Место защиты: Рос. гос. аграр. ун-т] - Брянск, 2009 - Количество страниц: 163 с. ил. Брянск, 2009 163 c. :

Физическое описание: 163 стр.

Выходные данные: Брянск, 2009






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
11 Вирусные болезни малины
12 Способы передачи ВККМ и других вирусов'
13 Симптомы поражения ВККМ растений рода Rubus
14 Проблемы распространения ВККМ в посадках малины
15 Круг растений, поражаемых ВККМ
16 Систематическое положение ВККМ и свойства вирусных частиц
17 Характеристика изолятов ВККМ
18 Эффективность методов оздоровления малины от ВККМ и других вирусных болезней
19 Методы диагностики ВККМ и других вирусов
110 Создание сортов малины, устойчивых к ВККМ
ГЛАВА 2 МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Характеристика объекта исследований
22 Выделение РНК из растений малины
221 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции гуанидинизотиоционатом
222 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолхлороформенным методом с применением для экстракции SDS
223 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции горячим фенолом
224 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолтриизопропилнафталинсульфонатным методом
23 Расчет концентрации РНК и определение качества полученных препаратов
24 Разработка методики диагностики ВККМ с помощью RT-PCR
241 Обратная транскрипция
242 Полимеразная цепная реакция
25 Конструирование вектора, содержащего фрагмент ВККМ
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины
32 Диагностика вируса кустистой карликовости малины в тканях малины методом RT-PCR
321 Характеристика праймеров, используемых для диагностики ВККМ методом RT-PCR
322 Положительные и отрицательные контроли при проведении RT-PCR
323 Влияние концентрации РНК малины для обратной транскрипции на протекание RT-PCR
324 Влияние методов выделения РНК на эффективность диагностики ВККМ в тканях малины методом RT-PCR
33 Скрининг ВККМ методом RT-PCR' в полевых растениях, сеянцах и пробирочных растениях малины, размножаемой в культуре in vitro
331 Анализ ВККМ в цветущих растениях и сеянцах некоторых форм малины в полевых условиях
332 Диагностика ВККМ в растениях ремонтантной малины на разных стадиях годового цикла развития
333 Анализ ВККМ в растениях ремонтантной малины, размножаемых в культуре in vitro
34 Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВККМ, распространенного в посадках малины

Введение:
В настоящее время во всем мире описано около 30 вирусных болезней малины, снижающих ее урожайность и ухудшающих качество посадочного материала [Приходько, 1992; Martin, 2002; Jones, 2004; Упадышев, 2004]. Наиболее распространенным и трудноконтролируемым патогеном малины и ежевики является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который выявлен практически во всех областях возделывания культурных растений рода Rubus: в Восточной и Западной Европе, Скандинавии, Северной и Южной Америке, Австралии, Новой Зеландии, Южной Африке, Китае [Baumann, 1986; Jones, 1992; Kokko, 1996а; Spak, 1997; Martin, 1999; Chamberlain, 2003; Pearson, 2005]. Поражая различные сорта малины, ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При заболевании растений число костянок в ягодах снижается до 10-12 шт., в то время как в норме доходит до 60 [Strik, 2003]. ВККМ способен снижать урожайность на 50 % даже при бессимптомном протекании болезни [Murant, 19766]. В естественных условиях вирус передается с пыльцой и при семенном размножении. До 77 % сеянцев, полученных из семян инфицированной красной малины, поражены ВККМ [Jones, 1996а]. Все это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных плантациях особенно сложным.
Проведенное в 1991-1996 гг. обследование селекционных посадок ма ф лины Кокинского опорного пункта ВСТИСП (Брянская область) показало присутствие некоторых опасных вирусных заболеваний — BMP, ВКПМ, ВЛКПЗ, ВЧКТом с различной степенью встречаемости (от 6% до 44 %) [Приходько, 1997]. Однако это обследование не включало скрининг материа Далее ОП ВСТИСП (Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниковод-ства) ла на наличие и распространение ВККМ, хотя в посадках малины повсеместно обнаруживается появление «рассыпчатых» и деформированных плодов, что свидетельствует о возможном присутствии данного вируса в селекционном материале.
Одним из основных методов диагностики вирусов, в том числе и ВККМ, является иммуноферментный анализ [Converse, 1976; Auger, 1982; Spak, 1995, 1999; Kolber, 1998]. Данный метод широко используется для регулярного проведения скрининга ВККМ на плантациях малины и ежевики в Европе и США [Baumann, 1988; Martin, 1998а, 1999; Strik, 2003; Чернец,
Другим высокочувствительным методом обнаружения растительных РНК-содержащих вирусов, к которым и относится ВККМ, является метод RT-PCR [Gillaspie, 2001; Pluta, 2002; Jones, 20026; Olmos, 2004; Yardimci,
2008]. В последние десятилетия, в связи с появлением нового RB штамма ВККМ, поражающего сорта, устойчивые к обычным S изолятам вируса, а также с обострением проблемы контроля за распространением патогена, разработана методика обнаружения ВККМ на основе метода IC-RT-PCR [Kokko, 19966]. Эта методика позволяет анализировать вирус в растениях независимо от проявления симптомов. Диагностика ВККМ проводится также с помощью метода RT-LAMP [Wang, 2005, 2008].
Отечественные разработки методов анализа ВККМ отсутствуют, а готовые коммерческие наборы для его обнаружения труднодоступны. В зарубежной литературе имеется упоминание о наличии ВККМ в образцах из России [Jones, 1998в], но информация о его распространении и характеристика местных изолятов на территории РФ отсутствует.
Поэтому, в настоящее время представляется актуальной разработка удобной и доступной методики диагностики ВККМ в растениях малины, которая позволит:
• своевременно выявлять вирус и получать здоровый посадочный материал;
• контролировать распространение ВККМ в селекционных питомниках и производственных плантациях;
• проводить селекцию, направленную на получение устойчивых или толерантных к ВККМ сортов малины.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлась разработка методики диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, а также оптимизация условий анализа вируса в различных сортах и формах малины в полевых условиях и in vitro.
Для разработки методики решались следующие задачи:
• Подбор оптимального метода для выделения РНК малины.
• Выбор праймеров, обеспечивающих специфическую и эффективную амплификацию фрагментов вирусного генома.
• Разработка системы положительных и отрицательных контролей и подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.
Для проверки работоспособности методики диагностики ВККМ и характеристики местного изолята вируса предполагалось провести:
• Скрининг ВККМ в растениях различных сортов и форм малины Кокинского ОП ВСТИСП в полевых условиях и в культуре in vitro.
• Изучение возможности передачи вируса при семенном размножении различных сортов и форм малины.
• Изучение возможности обнаружения вируса в различных тканях малины в зависимости от стадии годового цикла развития растений.
• Клонирование фрагмента гена белка оболочки ВККМ и определение его нуклеотидной последовательности для идентификации штамма, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Научная новизна и значимость. На основе RT-PCR разработана доступная методика чувствительного анализа вируса кустистой карликовости в инфицированных растениях малины.
Осуществлен подбор последовательностей праймеров для амплификации нескольких участков гена белка оболочки РНК-2 ВККМ.
Впервые проведено частичное обследование на наличие ВККМ полевого и лабораторного материала малины, в том числе и ремонтантной. Все изученные формы содержали вирус. Подтверждена способность вируса передаваться при семенном размножении ремонтантной малины. Выявлены толерантные к ВККМ сорта малины. Показано, что выделение меристем ремонтантной малины и введение в культуру in vitro, не приводит к освобождению от ВККМ.
Определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента гена белка оболочки ВККМ длиной 383 bp. Установлено, что изолят ВККМ, распространенный на территории Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с изолятом R15, относящимся к группе RB штаммов.
Практическая ценность исследований. Разработана методика диагностики ВККМ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода RT-PCR. Составлены наборы, предназначенные для анализа ВККМ в полевых и лабораторных растениях малины, культивируемых in vitro.
Данная методика необходима для производства безвирусного посадочного материала, а также при проведении селекции малины, направленной на создание сортов, устойчивых к ВККМ.
Получена генетическая конструкция, содержащая фрагмент гена белка оболочки ВККМ, которая может быть использована для создания модельных трансгенных растений малины при изучении механизмов устойчивости к вирусу, а также для получения резистентных к ВККМ сортов малины.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Методика обнаружения ВККМ на основе RT-PCR.
2. Скрининг ВККМ в полевом и лабораторном материале малины.
3. Идентификация штамма ВККМ, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), II Вавиловской международной конференции* «Генетические ресурсы культурных, растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статья в журнале «Сельскохозяйственная биология», включенном в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из, введения, четырех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложения. Объем работы составляет 163 страницы. В диссертации содержится 22 рисунка и 9 таблиц. Список использованной литературы содержит 251 источник, в том числе 218 работ иностранных авторов.