Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биофизика

Основные белки митохондрий и их роль в сохранении митохондриальной ДНК

Диссертация

Автор: Гуляева, Наталья Александровна

Заглавие: Основные белки митохондрий и их роль в сохранении митохондриальной ДНК

Справка об оригинале: Гуляева, Наталья Александровна. Основные белки митохондрий и их роль в сохранении митохондриальной ДНК : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02 Пущино, 2007 116 c. : 61 07-3/447

Физическое описание: 116 стр.

Выходные данные: Пущино, 2007






Содержание:

1 СПИСОК ПРИНЯТЫХ в РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ
Глава
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРБ
11 МтДНК чувствительная мишень для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов
12 ДНКсвязывающие белки ядер и их роль в обеснечении защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов
13 ДЬЖ-связывающие белки митохондрий клеток млекопитающих
Глава
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТ0ДБ
21 Животные
22 Основные химические реактивы
23 Радиационная обработка
24 Выделение митохондрий и ядер из тканей крыс и мышей
25 Очистка митохондрий в градиенте сахарозы
26 Очистка митохондрий с использованием дигитонина
27 Получение нуклеоидов митохондрий
28 Выделение кислоторастворимых белков митохондрий и гистонов ядер из печени и селезенки
29 Очистка белков на ДЭАЭ-целлюлозе
210 Получение ДНК-белковых комплексов in vitro
211 Обработка ДНК-белковых комплексов перекисью водорода
212 Исследование образования ДНК-белковых комплексов с помощью актиномицина Д
213 Выделение мтДНК с использованием фенола
214 Выделение мтДНК на магнитных сорбентах
215 SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле
216 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
217 Определение количества ДНК-белковых сшивок
218 Определение АДФ-рибозо-синтетазной активности
219 Определение концентрации белка
220 Определение концентрации Д Н К снектрофотометрическим методом
221 Определение содержания Д Н К флуоресцентным методом
222 Статистическая обработка Г Л А В А
223 РЕЗУЛЬТАТЫ И И Х О Б С У Ж Д Е Н И Е
224 Основные кислоторастворимые белки в митохондриях
225 Исследование комплексирования основных белков митохондрий с ДНК in vitro
226 Выяснение возможной ассоциации белков и мтДНК в митохондриях in vivo
227 Формирование ДНК-белковых сшивок в митохондриях тканей крыс, подвергнутых радиационному воздействию
228 Активация поли(АДФ-рибозил)ирования белков в митохондриях тканей крыс, подвергнутых радиационному воздействию
229 Участие белков нуклеоидов митохондрий в защите мтДНК при действии повреждающих агентов ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СНИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 5О

Введение:
Клетки млекопитающих содержат не только ядерную ДНК (яДНК), но и митохондриальную ДНК (мтДНК), которая составляет около 1,0% от общей ДНК различных тканей [Shadel and Clayton, 1997]. Несмотря на то, что мтДНК у млекопитающих была открыта более 40 лет назад, в последние 10-15 лет интерес к изучению молекулярных механизмов ее функционирования, мутагенеза, сохранения и стабилизации в клетках значительно повысился в связи с выявлением множества «митохондриальных» заболеваний, с выяснением роли мтДНК в клеточной гибели, канцерогенезе, старении. Известно, что культивируемые in vitro лишенные мтДНК клетки (r/zo") и могут жить в определенных условиях, тем не менее, целостность митохондриального генома для жизни многоклеточного организма является критической. В митохондриях в процессе окислительного фосфорилирования образуется значительное количество активных форм кислорода (АФК), способных вызывать близость повреждения мтДЕК и других макромолекул. мтДНК к комплексам белков-ферментов Но-видимому, цепи, этих дыхательной мишенью для генерирующей АФК, делает ее легко доступной окислителей. Кроме того, мтДНК in vivo более подвержена воздействию экзогенных химических и физических агентов, чем яДНК. В течение более, чем 10 лет в различных статьях и фундаментальных обзорах высказывается точка зрения о том, что повышенная повреждаемость мтДНК в клетках млекопитающих в значительной мере обусловлена отсутствием в митохондриях гистонов, образующих комплексы с мтДНК и обеспечивающих ее защиту от действия АФК, как в случае с я ДНК [Kang and Hamasaki, 2005; LeDoux and Wilson 2005; Wallace, 2005]. Известно, что яДНК в клетках высших организмов в значительной мере экранирована гистонами и негистоновыми белками от действия АФК и других повреждающих агентов. Эти белки обеспечивают компактную укладку яДНК в составе хроматина, ее структурную организацию и функционирование.Значительная часть негистоновых белков хроматине представлена ферментами и полипептидами, регулирующими функционирование ДНК [Berezney, 2002; Gilbert et al., 2005]. О прочной ассоциации этих белков с ДНК в составе ядерного хроматина свидетельствует то, что при действии окислителей или других агентов на клетки образуются ДНК-белковые сшивки (ДБС). Известно также, что ДДК в клетках бактерий комплексирована с белками, в том числе гистоноподобными, формируя нуклеоид или бактериальный хроматин [Azam and Ishihama, 1999; Travers and Muskhelishvili, 2005]. Топология структуры бактериальных хроматина клеток клеток высших в организмов и от нуклеоида меняется зависимости функционирования процессов репликации, рекомбинации, репарации и транскрипции в клетках. Гистоны и негистоновые белки хроматина, а также белки в составе бактериальных нуклеоидов являются кислоторастворимыми, что дает методическое преимущество для их экстрагирования и анализа [Yu and Bender, 1995]. Что касается мтДНК, то вопросы о ее структурнофункциональной организации в митохондриях и возможности формирования комплексов м т Д Ж с белками, способными снижать атаки АФК и других повреждающих агентов на митохондриальный геном, к началу наших исследований оставались не достаточно ясными. Развитие исследований в этом направлении важно в для понимания путей защиты, сохранения в генетического материала митохондриях, косвенно участвующего регуляции множества клеточных процессов. Более того, хорошо установлено, что накопление значительного количества повреждений в мтДНК клеток приводит к ухудшению энергозависимого метаболизма в тканях, развитию различных патологий (нейропатии, миопатии, кардиопатии, диабета), дегенеративных процессов, ускорению старения и гибели клеток [LeDoux and Wilson 2005; Wallace, 2005]. Поэтому наше исследование было направлено на изучение основных (ДНК-связываюших) белков в митохондриях клеток млекопитающих и роли этих белков в сохранении мтДНК в условиях повышенного окислительного стресса. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании ДЬЖ-связывающих основных белков митохондрий клеток млекопитающих и способности этих белков в составе Д1Ж-белковых комплексов снижать повреждения мтДНК. В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Выяснить наличие ДРЖ-связывающих основных белков в митохондриях тканей крыс, определить комплексы с ДНК in vitro. 2. Исследовать ДНК-белковые комплексы в митохондриях ш vivo по формированию ДЬЖ-белковых сшивок и активации поли(АДФих состав и способность формировать рибозил)ирования белков, индуцируемых ионизирующим излучением. 3. Исследовать способность основных белков митохондриальных индуцируемых нуклеоидов снижать уровень повреждений мтДНК, перекисью водорода и ионизирующей радиацией. Научная новизна работы. Впервые более 20 установлено, основных что митохондрии млекопитающих содержат ДНК-связывающих полипептидов, которые образуют комплексы с Д1Ж ш vitro, аналогично ядерным гистонам. Впервые показано, что ионизирующая радиация вызывает образование ДНК-белковых сшивок и активацию поли(АДФживотных, рибозил)ирования белков в митохондриях тканей облученных также как и в ядрах, что свидетельствует о существовании in vivo в митохондриях ДНК-белковых комплексов и связи мтДНК с поли(АДФрибозил)полимеразой, активируемой при возникновении разрывов цепей мтДНК. Впервые продемонстрировано, что основные белки, образующие комплексы с мтДРЖ и формирующие с ней компактные структуры нуклеоиды, обеспечивают защиту митохондриального генома, как и гистоны яДНК, от повреждающего действия ионизирующего излучения и перекиси водорода. Практическая ценность работы. Представленные в настоящей работе результаты исследования имеют существенное значение для понимания путей защиты, сохранения генетического материала митохондрий, участвующего в регуляции множества клеточных процессов. Результаты этой работы представляют несомненный практический интерес, носкольку могут быть использованы при разработке способов повышения устойчивости мтДНК, регуляции энергозависимых процессов и метаболической коррекции различных патологий.