Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

Регуляция экспрессии гена интестинального муцина MUC2 в нормальных и опухолевых клетках

Диссертация

Автор: Грачев, Алексей

Заглавие: Регуляция экспрессии гена интестинального муцина MUC2 в нормальных и опухолевых клетках

Справка об оригинале: Грачев, Алексей. Регуляция экспрессии гена интестинального муцина MUC2 в нормальных и опухолевых клетках : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.00 Б. м., 2001 113 c. : 61 06-3/946

Физическое описание: 113 стр.

Выходные данные: Б. м., 2001






Содержание:

Содержание -d КТТАГПТТАРНПРТМ -7 КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ НА АНГЛИЙСКОМ ЯЗЫКЕ КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ in
11 Рак ободочной и прямой кишки
111 Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки
112 Муцинозные опухоли толстого кишечника
12 Метилирование ДНК
121 Функция метилирования ДНК в прокариотах
122 Различия метилирования ДНК в эукариотах и прокариотах
123 Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках
124 CpG островки
125 Регуляция экспрессии с помошью метилироваиия ДНК
13 Роль метилирования ДНК в канцерогсиезе
131 Мутации метилированной ДНК
132 Снижение среднего уровня метилирования ДНК в опухолевых клетках
133 Региональное гиперметилирование в опухолях ЦЕЛИ НРЕДСТАВЛЕННОЙ РАБОТЫ М А Т Г Р И А TIKT И MFTOJITiT У!
31 Образцы ткани
311 Подготовка срезов тканей для микродиссекции
32 Микродиссекция Клеточные линии
33 Реактивы
331 Растворы и среды
332 Киты для молекулярной биологии
333 Рестрикционные ферменты
334 Модифицирующие фермеиты
335 Праймеры и олигонуклеотиды
3351 Праймеры для ПЦР
33512 Промотор MUC
33513 Учасгок 1-го интрона гена MUC
33514 Последовательность промотора гена MUC2 обработанного бисульфитом
33515 Мстилтрансфераза DNMr2 (Асе AF045888) Содержание
33516 Мегилтрансфераза DNMT1 (Аес Nr Х63692)
33517 p21waf(Acc Nr:U03106)
33518 PDH (Асе Nr D90086)
3352 Стандартные праймеры для реакцнн снквенирования
3353 Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension)
336 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3361 Анализ экспрессии MUC
3362 Амплификация участка промотора гена MUC
3363 Амплификация первого интрона гена MUC
3364 Амплификация обработанной бисульфитом ЩЖ из клеточных линий
3365 Амплификация обработанной бисульфнтом ДНК из срезов тканей
3366 ПЦР для метилгрансферазы DNMT
3367 ПЦР для мегилгрансферазы DNMT
3368 ПЦР обработанной бисульфитом плазмидной ДНК
3369 Внесение мутаций в промотор MUC2 с помощью ПЦР
337 Зонды для Норзерн и Саузерн блот гибридизации
3371 Анализ экспрессии гена MUC2 с помощью Норзерн блот гибридизации
3372 Зонды для Саузерн блот гибридизации
3373 Олигонуклеотид, содержащий первые Ьр кДНК гена MUC2 -3-17 пРНК"
3375 Проба для р
3376 Зонд для гена Люциферазы
338 Плазмидные вектора
3310 Геномная библиотека
34 Методы анализа фага Я
341 Культура фага на чашках Петри
342 Определение титра фага
343 Скрининг фаговой библиотеки с помощью ПЦР
344 Приготовление фаговой суспензии с высоким титром
345 Выделение препаративных количеств ДОК фага лямбда
35 Выделение нлазмнд
351 Трансформация Ecoli
352 Вьщеление аналитических количеств плазмидной ДНК
353 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК
354 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
355 Конструирование плазмид
356 Клонирование гфодукта ПЦР в вектор ТОРО ТА
36 Анализ эксирессии генов
361 Вьщеление тотальной РНК
362 Норзерн блот гибридизация
3621 Приготовление геля
3623 Мечение зондов
362A Гибридизация мембран
363 Обратная транскрипция-ПЦР (RT-ГЩР)
3631 Синтез кДНК
37 Анализ метилирования ДНК
371 Саузерн блот гибридизация
372 Анализ метилирования ДНК с помощью бисульфитного сиквенирования
373 Анализ метилирования при помощи SNuPE
374 Ингибирование метилирования 5-аза-2-деоксицитидином Содержание
38 Репортерный анализ активности промотора
381 Метилирование ДНК in vitro
382 Трансфекция эукариотических клеток
383 Определение активности люциферазы и р-галактозидазы
384 Нормализация эффективности трансфекции при помощи дот блот гибридизации
41 Выделение и анализ нромотора гена MUC
411 Получение клона фага лямбда содержащего 5участок геиа MUC
412 Сиквенирование и анализ промотора
413 Анализ регуляции промотора MUC
42 Метилирование промотора в различных клеточных линнях
421 Метилирование промотора MUC2 в клетках экспрессирующих и не экспрессирующих MUC
422 Анализ метилирования промотора MUC2 бисульфитным сиквенированием
423 Подавление метилирования приводит к активации MUC
43 Метилирование нромотора MUC2 в клоннрованных клетках
431 Подавление метилирования и получение клонов
432 Метилирование промотора MUC2 в полученных клонах
433 Изменения экспрессии генов в клонах
44 Влияние сайт-специфичного метилирования на активность промотора
441 Влияние метилирования на активность промотора в различиых клеточных линиях
442 Анализ мутаций цитозинов в CpG сайтах #5 и #
443 Анализ потеициального de novo метилирования или деметилирования трансфецированной плазмиды
45 Метилирование нромотора MUC2 в тканях
451 Использование микродиссекции
452 Анализ метилироваиия промотора MUC2 в тканях
453 Метилирование промотора MUC2 в бокаловидных клетках
54 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Анализ носледовательности промотора MUC2 Регуляпня экспрессии MUC2 в клеточных линиях Регуляция экспрессии MUC2 в нормалн>ной и онухолевой тканях Роль метилирования нри развитии муцинозных карпином
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение:
10 1.1 1.1.1 Введение Рак ободочной и прямой кишки Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки Высокие показатели смертности от рака ободочной и прямой кишки (колоректального рака) во всем мире [1] послужили предпосылкой для его всестороннего изучения. В 1990 году Феарон (Fearon) и Фогельстейн (Fogelstein) предложили модель многоступенчатого процесса развития колоректальной карциномы [2]. Авторы предположили, что в процессе развития опухоль проходит через несколько стадий характеризующихся сериями генетических изменений, охватывающих онкогены [3] и гены-супрессоры [4]. Аденомы, развиваясь из нормальных эпителиальных клеток, проходят через несколько стадий дисплазии, и развиваются в карциному [2]. Инвазивная опухоль продолжает развиваться, и накопление новых генетических изменений коррелирует со способностью опухоли метастазировать. Этот длительный, многоступенчатый процесс занимает годы, а иногда десятилетия [2]. Среди генов-супрессоров, играющих роль при развитии колоректального рака, наиболее хорошо изучен ген р53. Мутации этого гена описаны для различных типов опухолей [4]. В случае рака ободочной и прямой кишки, мутации в области гена р53 обнаруживаются в 70% случаев спорадических опухолей [5]. Белок, кодируемый этим геном, отвечает за контроль повреждения ДВЖ, приводя к аресту клеточного цикла в фазе G1, что дает возможность системе репарации ДНК устранить повреждение. Если же репарация невозможна, р53 запускает программируемую клеточную гибель апоптоз. Мутации р53, как правило.Введение
11_ обнаруживаются на поздних стадиях прогрессии от аденомы к карциноме. Таким образом, в большинстве ранних аденом мутации р53 не встречаются [4]. Инактивируюшие мутации другого гена-супрессора АРС (adenomatous polyposis coli) считаются наиболее ранним событием в процессе развития колоректального рака [6]. Наследственные мутации этого гена ведут к развитию семейного аденоматозного полипоза кишечника, для которого характерно развитие опухолей кишечника в раннем возрасте. Эти данные позволяют предположить необходимость АРС для регуляции пролиферации эпителия кишечника. В спорадических колоректальных опухолях мутации АРС встречаются в 60-80% случаев [7]. Мутации онкогена Ki-ras обнаруживаются в 50% случаев опзолей обводной и прямой кишки [2]. Частота мутаций на поздних стадиях развития опухолей мало отличается от частоты мутаций обнаруживаемых в крупных аденомах [2]. Кроме того мутации гена Ki-ras обнаруживались в 13% 58% случаев фокусов аберрантных кишечных крипт [8,9], считаюшихся предшественниками опухолей. Таким образом активация онкогена Ki-ras является ранним событием при развитии опухолей обводной и прямой кишки. Исследования так называемого наследственного не-полипозного колоректального рака (HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer) позволили описать дополнительную группу генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза [10]. Первый из описанных генов hMSH2 относится к семейству генов отвечаюших за исправление ошибок репликации ДНК [11]. Следующий компонент системы репарации неспаренных оснований hMLHl был описан в 1994 Броммером (Brommer) с коллегами [12]. Мутации в этих двух генах были обнаружены в 60% Введение 12 исследованных случаях HNPCC. Кроме того в нескольких случаях HNPCC были обнаружены мутации в двух других компонентах системы репарации неспаренных оснований PMS1 и PMS2 [13]. Потеря этих генов, не являющихся классическими онкогенами, приводит, тем не менее, к существенному повышению вероятности мутаций ведущих, в свою очередь, к злокачественной трансформации. 1.1.2 Муцинозные опухоли Фенотипический анализ опухолей ободочной и прямой кишки позволяет ввести классификацию на основании количества содержащихся в них муцинов. Опухоли, в которых муцины составляют не менее 50% их массы, классифицируются как муцинозные. Муцинозные опухоли составляют около 1020% всех опзсолей ободочной и прямой кишки. Спорадические опухоли реже имеют муцинозный фенотип, чем наследственные (например HNPCC) [14]. Клинические исследования показали, что для муцинозных карцином молочной железы, яичника [15] и поджелудочной железы [16] характерен более благоприятный прогноз, чем для немуцинозных. В случае колоректального рака данные остаются противоречивыми [17-19]. Стоит заметить, что фенотипические различия коррелируют с различным спектром мутаций. Так мутации гена р53 встречаются только в 30% муцинозных карцином [20,21], в то время как мутации протоонкогена Ki-ras более часты в муцинозных карциномах (70%) опухолями (50%) [14]. Однако наиболее строгим молекулярным различием между муцинозными и немуцинозными опухолями является повышенная экспрессия гена интестинального по сравнению с неклассифицированными Введение 13 муцина MUC2 в 100% случаев муцинозных карцином [22]. Ген MUC2 кодирует секретируемый муцин, производимый в большом количестве в нормальном толстом кишечнике. Экспрессия гена MUC2 существенно понижена в немуцинозных опухолях по сравнению с нормальной слизистой толстого кишечника. Особенно интересен анализ усиления экспрессии MUC2 на разных стадиях развития колоректального рака. На стадии аденомы, статистически значимое усиление экспрессии гена MUC2 наблюдалось во всех исследованных случаях. В процессе дальнейшего развития аденомы в карциному экспрессия MUC2 изменяется в соответствии с фенотипом развивающейся опухоли. В случае немуцинозной опухоли экспрессия снижается ниже уровня наблюдаемого в нормальной ткани [22], а в слзае муцинозной опухоли продолжает повышаться (Рис. 1) [14,20]. Представленные данные позволяют предположить, что развитие муцинозных и не-муцинозных сопровождается карцином протекает по генетически различным путям и накоплением различных молекулярных изменений. Хотя прогностическая ценность повышенной экспрессии MUC2 не определена, это единственное молекулярное изменение, ассоциированное с муцинозным фенотипом в 100% случаев. Описание молекулярного механизма повышения экспрессии гена MUC2 позволит лучше описать процесс развития опухолей ободочной и прямой кишки.Введение 14 Муцинозные опухоли о о а. 1.2 Норма Аденома Не-муцинозные опухоли Карцинома Рисунок 1. Изменение экспрессии MUC2 в процессе развития колоректальной карциномы. Метилирование ДНК Физиологическое метилирование ДНК единственная ковалентная модификация молекулы ДНК осуществляется путем переноса метильной группы с S-аденозил метионина на 5-ю позицию пуринового кольца цитозина. Метилирование ДНК обнаруживается на разных стадиях эволюции в таких различных организмах как Е.соИ и H.sapience. Однако некоторые виды, такие как D.melanogaster обходятся без метилирования ДНК [23]. 1.2.1 Функция метилирования ДНК в прокариотах Метилирование ДЬЖ в бактериях подверглось тщательному и всестороннему исследованию. В бактериях, наряду с цитозином, метилированию подвергается также и аденин. Эта модификация служит для функциональной организации генома и играет роль при репликации. Существует целое семейство ферментов ДЬЖ метилтрансфераз (DNA-MTases), катализирзтощих метилирование цитозина в различных последовательностях [24]. Ещё одна функция метилирования ДНК в бактериях это обеспечение механизма распознавания чужеродной ДНК. Рестриктные эндонуклеазы способны отличить чужеродную ДНК от эндогенной на