Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биофизика

Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах

Диссертация

Автор: Витухновская, Лия Алексеевна

Заглавие: Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах

Справка об оригинале: Витухновская, Лия Алексеевна. Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02 Б.м., Б.г. 126 c. : 61 06-3/194

Физическое описание: 126 стр.

Выходные данные: Б.м., Б.г.






Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Структурные особенности цитохромного А«/комплекса
111 Дополнительный гем на стромальной поверхности Q4 сайта (гем х) и его функции
112 Хлорофилл а, /?- каротинойд и эндогенные липиды
113 Сходство и различие цитохромного й^комплекса с цитохромным bci комплексом
12 Перенос электронов в цитохромном btf комплексе
121 Перенос электронов от хинола к высокои низкопотенциальным цепям
122 Перенос электронов к цитохрому/ через протеид Риске
123 Электрогенные реакции в к ; и в ^комплексе
124 Циклический транспорт электронов
125 Ингибиторы /^комплекса
13 Перенос электронов от цитохрома/ к фотосистеме
14 Структурные аспекты ФС
141 Строение цианобактериальной ФС
142 Строение эукариотической ФС
15 Электрон- транспортная цепь
151 Современные данные по переносу электронов в ФС
1511 Первичный перенос электронов (от возбужденного Р700 черезАокАО
1512 Вторичный перенос электронов ( от А{ к железо- серным кластерам F x F A FB)
1513 Перенос электронов от FB на ферредоксин/ флаводоксин
16 Фотосинтетические гибридные системы в растворе
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
211 Используемые реактивы
212 Выращивание клеток Synechocystis sp РСС
213 Выделение фотосистемы
214 Выделение цитохромного 6,/комплекса
215 Измерение активности цитохромного 6,/комплекса
216 Выделение пластоцианина
217 Выделение цитохрома ев
218 Химическое восстановление децилпластохинола
219 Получение протеолипосом
22 АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
221 Измерение спектров оптического поглощения
222 Светоиндуцированные изменения оптического поглощения
223 Регистрация светоиндуцированной кинетики генерации трансмембранного потенциала в гибридных системах
224 Кинетический анализ сигналов
225 Измерения спектров ЭПР
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
31 Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цитохромного btf комплекса и ФС в растворе
311 Взаимодействие ФС в гибридной системе с донором электронов цит ев в растворе
312 Исследование гибридной системы в растворе с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии
32 Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цит b$f комплекса и ФС в протеолипосомах
321 Ориентация цитохромного ^комплекса и ФС в протеолипосомах
322 Исследование сопряжения белков в протеолипосомах методом импульсной абсорбционной спектрометрии
323 Изучение гибридной системы методом электронного парамагнитного резонанса
324 Исследование гибридных протеолипосом, содержащих ФС и цит 6,/комплекс методом ЭПР
3241 Регистрация Д\|/ в протеолипосомах

Введение:
Актуальность проблемы. Исследование фотосинтеза, как комплекса реакций превращения солнечной энергии в энергию химических связей, представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии.В фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) высших растений, водорослей и цианобактерий функциональными блоками являются фотосистемы (ФС) 1 и 2, а также цитохромный (цит) b$f комплекс, осуществляющий перенос электронов от липофильного двухэлектронного донора пластохинола на одноэлектронный водорастворимый белок пластоцианин (ПЦ) или цит с^ (альтернативный переносчик электронов у цианобактерий). Согласно классической линейной Z-схеме фотосинтетическая ЭТЦ обеспечивает расщепление воды с образованием кислорода на донорной стороне ФС 2 и восстановление НАДФ до НАДФН на акцепторной стороне ФС 1.В некоторых условиях (присутствие ингибиторов ФС 2, анаэробные условия) наблюдается циклический транспорт электронов, включающий только два пигмент-белковых комплекса фотосинтетической цепи - ФС 1 и цит bgf комплекс. Однако механизм этого процесса недостаточно изучен, поэтому исследование взаимодействия между ФС 1 и цит b<f комплексом представляется важной и актуальной проблемой.ФС 1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, сопряженное с транспортом электронов от периферических белков - цит сб или ПЦ к природным акцепторам - ферредоксину (или альтернативному акцептору электронов у цианобактерий - флаводоксину) от первичного донора электронов - димера хлорофилла Р700 через цепь кофакторов - Ао (хлорофилл а), А] (филлохинон или витамин К) и железосерные кластеры Fx, FA, FB.Цит btf комплекс, согласно схеме Q-цикла, предложенной Митчелом (Mitchell, 1975), окисляет молекулу пластохинола (PQH2) в хинол-оксидазном Qo-сайте. Окисление PQH2 сопровождается депротонированием, при этом один электрон поступает на высокопотенциальный участок цепи (железо-серный центр Риске - цит Д а другой - на цит Ь, восстанавливая связанную с хинонредуктазным сайтом Q; молекулу пластохинона (PQ) с образованием семихинона. При повторном обороте фермента семихинон анион-радикал восстанавливается до PQH2. Таким образом, в результате полного цикла работы b<f комплекса происходит окисление двух молекул PQH2, за которым следует выброс 4 Н* в люмен, поглощение 2 Н* из стромы и восстановление одной молекулы PQ в Q; сайте.Значительный прогресс в изучении этих двух белковых комплексов был связан с проведением рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС 1 из термофильной цианобактерии Synechococcus elongatus с разрешением 2,5 А (Jordan et al, 2001), и цит b<f комплекса из термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3,5 A (Kurisu et al., 2003) и из водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3,1 A (Stroebel et al., 2003). Были оценены расстояния между кофакторами ферментов, а таюке выявлены основные структурные особенности b$f комплекса, в частности, был найден новый, ковалентно-связанный гем х, по-видимому, относящийся к гемам типа с'.Предполагается, что гем х может участвовать в циклическом перенос электронов.Транспорт электронов между b(f комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах: листьях высших растений, хлоропластах, субхлоропластных частицах и клетках цианобактерии. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и b<f исследовали только в растворе (Rich et al, 1987). В нашей работе впервые была предпринята попытка изучить взаимодействие между этими двумя пигментбелковыми комплексами в мембранах протеолипосом с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, ЭПР спектроскопии и прямого электрометрического метода.Перенос электронов при функционировании b$f комплекса сопряжен с генерацией трансмембранной разности электрических потенциалов (Ау), образование которой до настоящего момента изучалось методом регистрации электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов в тилакоидах хлоропластов (Jones & Whitmarsh, 1988) и целых клетках (Joliot & Joliot, 1994, 1998). Этот метод, несмотря на широкое применение, является косвенным, и при интерпретации данных не вполне однозначным. Было предположено, что основная электрогенная стадия (70-75%) обусловлена переносом электрона между двумя темами Ь, в то время как оставшиеся 25-30% электрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома Ъ и/или с поглощением протонов из стромы при восстановлении PQ в сайте Q;. Тем не менее, анализ литературных данных показывает, что как механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием Ду в цит b$f комплексе, так и природа наблюдаемых электрогенных стадий остаются невыясненными.Более прямым способом регистрации образования мембранного потенциала является электрометрический метод, разработанный в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Ранее этот метод был успешно применен для изучения природы и механизмов электрогенных реакций в функциональном аналоге b$f комплекса - цитохромном be; комплексе пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Однако электрометрический метод не применим к целым клеткам и хлоропластам. Для регистрации мембранного потенциала этим методом необходимо было выделить комплексы b$f и ФС 1, встроить их в мембраны протеолипосом и подобрать условия эффективного взаимодействия. В настоящей работе электрогенные реакции, сопровождающие перенос зарядов в цит b$f комплексе были впервые исследованы в модельной системе. Применение прямого электрометрического метода позволяет с большей достоверностью определить природу электрогенных реакций в b<f комплексе и относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез.Целью настоящей работы явилось изучение генерации трансмембранной разности электрических потенциалов в цит b^f комплексе с промощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А.Н. Белозерского МГУ, в модельной системе, состоящей из выделенных белков ФС 1 и b$f комплекса. Для этого были проведены предварительные эксперименты с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии.Были поставлены следующие задачи: 1) Сконструировать функционально-активную гибридную систему, состоящую из ФС 1 и цитохромного b<f комплекса, а также продемонстрировать ее функционирование с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии.2) Подобрать условия встраивания ФС 1 и цитохромного b$f комплекса в мембраны протеолипосом и определить их ориентацию в мембранах.3) Исследовать индуцированные светозависимым окислением Р700 в ФС 1 редокс реакции цитохромов b и/ в растворе и в гибридных протеолипомах.4) Продемонстрировать взаимодействие между ФС 1 и цитохромным b$f комплексом в протеолипосомах путем регистрации светозависимых сигналов ЭПР от катион-радикала Р700 .5) С помощью прямого электрометрического метода изучить индуцированное лазерными вспышками образование трансмембранной разности электрических потенциалов, генерируемое цит b<f комплексом в гибридных протеолипосомах.Научная новизна работы. Впервые была сконструирована функциональноактивная модельная система, включающая выделенные пигмент-белковые комплексы цит btf и ФС 1 в мембранах протеолипосом. На основании результатов, полученных с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, продемонстрировано эффективное взаимодействие двух белков в этой системе. Окислительно-восстановительные реакции цит b и / инициировались светоиндуцированным окислением Р700.Были подобраны условия встраивания, при которых цит / b$f комплекса и Р700 ФС 1 оказались локализованными вблизи от внешней поверхности протеолипосомальной мембраны. Это условие было необходимо для сопряженного электронного транспорта, опосредованного экзогенным цит eg.Светозависимый перенос электронов в гибридных протеолипосомах был исследован с помощью ЭПР спектроскопии в Х-полосе. Взаимодействие между белковыми комплексами регистрировали по изменениям сигналов ЭПР от катион-радикала Р700+ при включении освещения. Сопряжение наблюдалось только в присутствии цит с6 и химически восстановленного DPQH2. Ингибитор Q0 сайта стигмателлин уменьшал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял темновой спад, что свидетельствовало о сопряженном переносе электронов от b$f комплекса к ФС 1.С помощью прямого электрометрического метода впервые были исследованы электрогенные реакции в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит b<f. Продемонстрировано наличие, по крайней мере, двух электрогенных стадий, обусловленных работой b$f комплекса: 1) NQNOчувствительной, связанной с протонированием PQ в сайте QJ; 2) стигмателлинчувствительной, связанной с переносом электрона между высокопотенциальным гемом bi и низкопотенциальным гемом Ьи, или с электрогенным выбросом протонов в сайте Q0 при окислении PQH2.Практическое значение работы. Результаты исследования существенно углубляют современные знания о природе и механизмах электрогенных реакций в цит b$f комплексе. Использование модельной системы позволяет более точно выявить относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез в b<f комплексе. Определение оптимальных условий встраивания и взаимной ориентации ФС 1 и b$f комплекса в мембранах протеолипосом может быть использовано для изучения взаимодействия между другими мембранными белками в модельных системах. Кроме того, фотосинтетические модельные системы могут быть использованы для мониторинга окружающей среды, в частности для детектирования загрязнений гербицидами и ионами тяжелых металлов.