Цена доставки диссертации от 500 рублей 

Поиск:

Каталог / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / Биофизика

Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток

Диссертация

Автор: Капралова, Ирина Владимировна

Заглавие: Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток

Справка об оригинале: Капралова, Ирина Владимировна. Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02 / Капралова Ирина Владимировна; [Место защиты: Ин-т биофизики клетки РАН] - Пущино, 2009 - Количество страниц: 131 с. ил. Пущино, 2009 131 c. :

Физическое описание: 131 стр.

Выходные данные: Пущино, 2009






Содержание:

Список сокращений
Введение
ГЛАВАI 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Методы микроинъекции (МИ)
1 2 Выживаемость зародышей животных и человека после МИ
13 Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты
1 4 Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей
15 Роль цитокина LIF в эмбриогенезе и имплантации
1 6 Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши
1 7 Методы получения ЭСК
1 8 Химерные зародыши и животные
ГЛАВА II
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2 1 Биологический материал
2 2 Ранние зародыши мыши
221 Выделение зародышей на стадии бластоцисты
222 Культивирование бластоцист in vitro
223 Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты
2 3 Клеточные культуры
231 Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши
232 Культивирование клеток ПЭФ
233 Приготовление митомицинового фидера ПЭФ
234 Культивирование ЭСК мыши
235 Культивирование и трансфекция клеток линии Cos-1
2 4 Микроинъекция (МИ)
241 Оборудования для проведения МИ
241 МИ в бластоцисты растворов и целых клеток
2 5 Оценка жизнеспособности бластоцист мыши в условиях культуры in vitro
251 Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ)
252 Иммуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog
2 6 Криоконсервация клеточных культур
261 Замораживание и хранение ЭСК,
ПЭФ и Cos-1 в жидком азоте
262 Режимы замораживания и размораживания клеточных культур
2 7 Состав сред и растворов, используемых для культивирования клеток и ранних зародышей
271 Модифицированная среда Виттена (МСВ)
272 Фосфатно-солевой буфер PBS
273 Раствор Версен-ЭДТА
274 Трипсин-ЭДТА
2 8 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА III
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 МИ в полость бластоцисты среды Виттена и витальных красителей
311 Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ
312 Развитие зародышей мыши со стадии бластоцисты in vitro
313 Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ
314 Влияние цитохалазина Б на эффективность культивирования мышиных бластоцист
315 Повышение эффективности культивирования бластоцист мышей в среде с цитокином LIF
316 МИ цитокина LIF в полость бластоцисты
3 2 Получение химерных бластоцист мыши
321 Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ
322 МИ в полость бластоцисты трансфицированных клеток линии Cos-1
323 Оценка флуоресценции зеленого белка GFP в первичных эмбриональных фибробластах (ПЭФ) мыши после МИ в бластоцисту
324 Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре
ГЛАВА IV 97 ВЫВОДЫ

Введение:
Проблема терапевтического и репродуктивного клонирования стала одной из самых популярных проблем современной клеточной биологии и медицины (Kuhholzer, Prather, 2000; Solter, 2000; Kawase et al., 2000; Wolf ef al., 2001; Illmensee, 2002; Wakayama et al., 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006). Одним из подходов для ее решения является микроинъекция (МИ) в ооциты или ранние зародыши чужеродных ядер, ДНК и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые обладают уникальной способностью встраиваться в развитие зародыша и передавать свои признаки по наследству (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Perry et al., 1999; Baguishi et al., 1999; Nagy et al., 1987; Nagy, Rossant, 2001; Nagy et al., 2003).
В последние годы методы МИ нашли практическое применение в работах по лечению бесплодия человека с помощью экстракорпорального оплодотворения - ЭКО, когда отдельный сперматозоид водится в цитоплазму ооцита (Галат, 2000; Lundin et al., 2001; Yoshida, 2007; Jones et al., 2008). Другая область применения МИ связана с решением проблем клонирования ЭСК животных и человека с генетически измененными свойствами (Wakayama et al., 2001; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, Hwang et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2006). После замены ядра ооцита на ядро таких клеток получают зародыши, генетический материал которых соответствует геному донора.
Подавляющее большинство исследований с применением техники МИ выполнено на экспериментальных моделях, в качестве которых использовали лабораторных мышей. Из этих работ следует, что выживаемость мышиных ооцитов после замены ядер не превышает 1-2 % из-за низкой способности соматических и эмбриональных ядер к репрограмированию в цитоплазме зрелого ооцита (Illmensee, Норре, 1981; Wilmut et al., 1997; McLaren, 2000; Hochedlinger, Jaenisch, 2003; Hwang et al., 2004). По данным литературы более высокий процент выживаемости реконструированных зародышей достигается при инъекции ЭСК в полость бластоцисты, как источника чужеродного генетического материала (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Nagy et al., 1987;
Nagy, Rossant, 2001; Rossant, 2001; Nagy et al., 2003). В этом случае из реконструированных бластоцист можно получить более 20 % генеративных химерных животных. Этот метод находит применение в различных трансгенных и ген-таргетированных технологиях с использованием в качестве векторных систем ЭСК.
В современной литературе господствуют представления о том, что способность инъецированных клеток встраиваться в развитие зародыша и его гаметогенез зависит от плюрипотентных свойств ЭСК (Robertson, 1986; Robertson et al, 1987; Bradley et al., 1992; Brown et al., 1992; Papaioannou, 1993; Yagi, 1993; Ueda et al., 1995; Longo et al., 1997; Rossant, Spence, 1998; Prelle et al, 1999; Rossant, 2001). При этом остаются в стороне и не рассматриваются вопросы влияния самой процедуры МИ на последующее развитие и выживаемость химерных зародышей и их способность продуцировать первичные колонии эмбриональных клеток в условиях in vitro.
Кроме того, недостаточно внимания уделяется вопросам влияния генома зародыша на свойства и межклеточные взаимодействия ЭСК на начальных этапах развития в составе бластоцисты, а также факторам, индуцирующим эти процессы in vitro. Плюрипотентные ЭСК мыши с одинаковой вероятностью включаются как в экстраэмбриональные ткани, так и в ткани самого зародыша. Выбор направления развития инъецированных клеток во многом носит случайный характер, и причины выбора остаются неизвестными. В связи с этим нам представлялось весьма интересным изучить характер распределения инъецированных клеток в составе бластоцисты и выяснить регуляторные возможности самих зародышей, оценить их способность к восстановлению морфологии и жизнеспособности после повреждений, вызванных МИ. Результаты таких исследований могут представлять большой интерес в медицинской практике.
Основной целью настоящей работы было получение с помощью метода МИ химерных бластоцист мыши и выявление характера распределения инъецированных эмбриональных и соматических клеток в химерном зародыше на начальных этапах его развития. Решали следующие задачи:
• Оценка жизнеспособности бластоцист различных линий мышей in vitro после МИ в полость растворов витальных красителей, среды культивирования, эмбриональных и соматических клеток.
• Исследование межлинейных различий в реакции бластоцист на МИ. Оценка характера повреждений бластоцист.
• Разработка методических приемов для повышения эффективности культивирования мышиных бластоцист in vitro.
• Оценка влияния цитокина LIF на развитие бластоцист в зависимости от способа его действия: опосредованно через среду культивирования или путем введения в полость бластоцисты.
• Подбор генетических маркеров и флуоресцентных красителей для идентификации инъецированных соматических и эмбриональных клеток в составе бластоцисты. Оценка характера их встраивания в бластоцисту.
• Получение химерных бластоцист и выявление различий в эффективности их культивирования в зависимости от генома инъецированных клеток.